【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本披露總體上涉及一種用于富集能夠結合生物樣品中的一種或多種生物分子的多個適體的方法。
技術介紹
1、指數富集的配體系統進化法(selex)是目前用于從具有隨機序列的大池中分離靶分子的高親和力適體的常用方法。可以選擇針對各種靶標的適體。適體對其靶分子具有高親和力和特異性。然而，已經開發了許多selex選擇方法用于分離靶向單個分子的適體。由于適體選擇的低成功率，選擇過程中的許多因素仍然不明確。
2、引用列表
3、專利文獻
4、[ptl?1]us2006/0160763
5、非專利文獻
6、[npl?1]keefe等人,aptamers?as?therapeutics[作為治療劑的適體].nat.rev.drug?discov[自然評論藥物發現].2010；9:537-550。
7、[npl?2]jayasena?s.d.aptamers:an?emerging?class?of?molecules?thatrival?antibodies?in?diagnostics[適體：在診斷學上與抗體相媲美的一類新興分子].clin.chem[臨床化學].1999；45:1628-1650
8、[npl?3]tuerk等人,systematic?evolution?of?ligands?by?exponentialenrichment:rna?ligands?to?bacteriophage?t4?dna?polymerase[指數富集的配體系統進化法：噬菌體
9、npl?4：ellington等人,in?vitro?selection?ofrna?molecules?that?bindspecific?ligands[結合特定配體的rna分子的體外選擇].nature[自然].1990；346:818-822。
10、npl?5：selex-a(registered?trademark)evolutionary?method?to?generatehigh-affinity?nucleic?acid?ligands[selex-一種(注冊商標)進化方法，用于產生高親和力核酸配體].biomolecular?engineering[生物分子工程],24(4):381-403。
11、npl?6：klug和famulok(1994).all?you?wanted?to?know?about?selex[你想知道的關于selex的一切].molecular?biology?reports[分子生物學報告],20:97-107。
12、npl?7：darmostuk等人(2015).current?approaches?in?selex:an?update?toaptamer?selection?technology[selex的當前方法：適體選擇技術的更新].biotechnology?advances[生物技術進展],33(6):1141-1161。
13、npl?8：morris等人,high?affinity?ligands?fromin?vitro?selection:complextargets[來自體外選擇的高親和力配體：復合靶標],proc?natl?acad?sci?u?s?a[美國國家科學院院刊].1998年3月17日；95(6):2902-2907。
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15、npl?10：hollenstein(2015)generation?of?long,fully?modified,and?serum-resistant?oligonucleotides?by?rolling?circle?amplification[通過滾環擴增產生長的、完全修飾的和血清抗性的寡核苷酸].organic?biomolecular?chemistry[有機生物分子化學],13:9829。
16、npl?11：kong等人(2016).generation?of?synthetic?copolymer?libraries?bycombinatorial?assembly?on?nucleic?acid?templates[通過核酸模板上的組合組裝產生合成的共聚物文庫].acs?combinatorial?science[acs組合科學],18:355-370。
17、npl?12：abraham等人,a?quick?and?effective?in-house?method?of?dnapurification?from?agarose?gel,suitable?for?sequencing[一種適用于測序的從瓊脂糖凝膠純化dna的快速和有效的內部方法],3biotech[3生物技術].2017年7月；7(3):180。
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20、npl?15：shao等人,emulsion?pcr:a?high?efficient?way?of?pcramplification?of?random?dna?libraries?in?aptamer?selection[乳化pcr：適體選擇中隨機dna文庫的高效pcr擴增方法],plos?one[公共科學圖書館綜合]6(9):e24910。
技術實現思路
1、技術問題
2、本披露的目的是提供用于富集能夠結合生物樣品中的一種或多種生物分子的多個適體的方法。本披露的另一個目的是提供用于分析靶生物樣品的靶適體文庫的方法。
3、問題解決方案
4、本披露至少部分地提供了用于使用電泳遷移率移位(例如，二維電泳)產生包含能夠結合復合樣品(例如，生物樣品)中的多個靶分子(例如，一種或多種生物分子)的多個適體的適體文庫的方法。在一些實施本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于富集能夠結合生物樣品中的一種或多種生物分子的多個適體的方法，該方法包括：
2.如權利要求1所述的方法，該方法進一步包括(v)擴增能夠結合這些生物樣品中的生物分子的該多個適體以形成適體文庫。
3.如權利要求2所述的方法，其中通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增能夠結合這些生物樣品中的生物分子的該多個適體。
4.如權利要求3所述的方法，其中該PCR是乳化PCR。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中步驟(ii)進一步包括從該第一電泳介質的其余部分切除包含該多個適體-生物分子復合物的該第一電泳介質的該部分。
6.如權利要求5所述的方法，其中將該第一電泳介質的該部分裝配到該第二電泳介質中的孔中，以在該第二方向上進行電泳。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中該第一電泳介質是第一瓊脂糖凝膠。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中該第二電泳介質是第二瓊脂糖凝膠。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中該第一和該第二電泳介質包含濃度在100mM與200mM之間的
10.如權利要求9所述的方法，其中該鈉離子呈氯化鈉的形式。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中該第一和該第二電泳介質包含濃度為10mM或更低的鎂離子、鈣離子、銅離子、鋅離子或其任何組合。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其中該第一和該第二電泳介質包含濃度在0.5mM與2mM之間的鎂離子、鈣離子、銅離子、鋅離子或其任何組合。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其中該第一和該第二電泳介質包含濃度為1mM的鎂離子、鈣離子、銅離子、鋅離子或其任何組合。
14.如權利要求11-13中任一項所述的方法，其中該鎂離子呈氯化鎂的形式。
15.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其中在該第一方向和該第二方向上的電泳在10℃與20℃之間的溫度下進行。
16.如權利要求1-15中任一項所述的方法，其中該生物樣品是血清、血漿、腦脊液(CSF)、尿液、羊水、骨髓、支氣管肺泡灌洗液、頰拭子、糞便、胃腸液、吸脂樣品、唾液、乳、鼻拭子、腹膜液、精液、痰、滑液、淚液、陰道液、組織活檢或細胞裂解物。
17.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中該生物樣品中的生物分子包含核酸、蛋白質、多肽、碳水化合物、脂質或其組合。
18.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其中該生物樣品未被變性。
19.如權利要求1-18中任一項所述的方法，其中在與該多個候選適體接觸之前，將該生物樣品以1:200與1:2之間的比率稀釋。
20.如權利要求1-19中任一項所述的方法，該方法進一步包括在與該多個候選適體接觸之前使該生物樣品與多個競爭核酸接觸。
21.如權利要求20所述的方法，其中該多個競爭核酸是一組隨機的不相關核酸。
22.如權利要求20或21所述的方法，其中該多個競爭核酸是鮭魚精子DNA。
23.如權利要求1-22中任一項所述的方法，其中該多個候選適體是單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈RNA或肽。
24.如權利要求23所述的方法，其中該多個候選適體是單鏈DNA(ssDNA)。
25.如權利要求24所述的方法，其中該多個候選適體中的每一個包含修飾的核苷酸。
26.如權利要求1-25中任一項所述的方法，其中該多個候選適體中的每一個被標記。
27.如權利要求26所述的方法，其中該多個候選適體中的每一個被熒光標記。
28.如權利要求1-27中任一項所述的方法，該方法進一步包括在步驟(iv)之前，從該第二電泳介質的其余部分切除含有該多個適體-生物分子復合物的該第二電泳介質的該部分，以及從該第二電泳介質的該部分提取該多個適體-生物分子復合物。
29.如權利要求2-28中任一項所述的方法，其中步驟(i)-(v)重復至少4次，并且其中當重復步驟(i)時，將步驟(v)中獲得的能夠結合生物樣品中的生物分子的該多個適體用作起始的多個候選適體。
30.如權利要求1-29中任一項所述的方法，其中(i)-(iv)重復至少9次，并且其中當重復步驟(i)時，將步驟(iv)中獲得的能夠結合生物樣品中的生物分子的該多個適體用作起始的多個候選適體。
31.如權利要求1-30中任一項所述的方法，該方法進一步包括鑒定能夠結合該生物樣品中的生物分子的該多個適體的序列。...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種用于富集能夠結合生物樣品中的一種或多種生物分子的多個適體的方法，該方法包括：
2.如權利要求1所述的方法，該方法進一步包括(v)擴增能夠結合這些生物樣品中的生物分子的該多個適體以形成適體文庫。
3.如權利要求2所述的方法，其中通過聚合酶鏈式反應(pcr)擴增能夠結合這些生物樣品中的生物分子的該多個適體。
4.如權利要求3所述的方法，其中該pcr是乳化pcr。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中步驟(ii)進一步包括從該第一電泳介質的其余部分切除包含該多個適體-生物分子復合物的該第一電泳介質的該部分。
6.如權利要求5所述的方法，其中將該第一電泳介質的該部分裝配到該第二電泳介質中的孔中，以在該第二方向上進行電泳。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中該第一電泳介質是第一瓊脂糖凝膠。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中該第二電泳介質是第二瓊脂糖凝膠。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中該第一和該第二電泳介質包含濃度在100mm與200mm之間的鈉離子、鉀離子、鋰離子、銨離子或其任何組合。
10.如權利要求9所述的方法，其中該鈉離子呈氯化鈉的形式。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中該第一和該第二電泳介質包含濃度為10mm或更低的鎂離子、鈣離子、銅離子、鋅離子或其任何組合。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其中該第一和該第二電泳介質包含濃度在0.5mm與2mm之間的鎂離子、鈣離子、銅離子、鋅離子或其任何組合。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其中該第一和該第二電泳介質包含濃度為1mm的鎂離子、鈣離子、銅離子、鋅離子或其任何組合。
14.如權利要求11-13中任一項所述的方法，其中該鎂離子呈氯化鎂的形式。
15.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其中在該第一方向和該第二方向上的電泳在10℃與20℃之間的溫度下進行。
16.如權利要求1-15中任一項所述的方法，其中該生物樣品是血清、血漿、腦脊液(csf)、尿液、羊水、骨髓、支氣管肺泡灌洗液、頰拭子、糞便、胃腸液、吸脂樣品、唾液、乳、鼻拭子、腹膜液、精液、痰、滑液、淚液、陰道液、組織活檢或細胞裂解物。
17.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中該生物樣品中的生物分子包含核酸、蛋白質、多肽、碳水化合物、脂質或其組合。
18.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其中該生物樣品未被變性。
19.如權利要求1-18中任一項所述的方法，其中在與該多個候選適體接觸之前，將該生物樣品以1:200與1:2之間的比率稀釋。
20.如權利要求1-19中任一項所述的方法，該方法進一步包括在與該多個候選適體接觸之前使該生物樣品與多個競爭核酸接觸。
21.如權利要求20所述的方法，其中該多個競爭核酸是一組隨機的不相關核酸。
22.如權利要求20或21所述的方法，其中該多個競爭核酸是鮭魚精子dna。
23.如權利要求1-22中任一項所述的方法，其中該多個候選適體是單鏈dna(ssdna)、雙鏈dna(dsdna)、單鏈rna或肽。
24.如權利要求23所述的方法，其中該多個候選適體是單鏈dna(ssdna)。
25.如權利要求24所述的方法，其中該多個候選適體中的每一個包含修飾的核苷酸。
26.如權利要求1-25中任一項所述的方法，其中該多個候選適體中的每一個被標記。
27.如權利要求26所述的方法，其中該多個候選適體中的每一個被熒光標記。
28.如權利要求1-27中任一項所述的方法，該方法進一步包括在步驟(iv)之前，從該第二電泳介質的其余部分切除含有該多個適體-生物分子復合物的該第二電泳介質的該部分，以及從該第二電泳介質的該部分提取該多個適體-生物分子復合物。
29.如權利要求2-28中任一項所述的方法，其中步驟(i)-(v)重復至少4次，并且其中當重復步驟(i)時，將步驟(v)中獲得的能夠結合生物樣品中的生物分子的該多個適體用作起始的多個候選適體。
30.如權利要求1-29中任一項所述的方法，其中(i)-(iv)重復至少9次，并且其中當重復步驟(i)時，將步驟(iv)中獲得的能夠結合生物樣品中的生物分子的該多個適體用作起始的多個候選適體。
31.如權利要求1-30中任一項所述的方法，該方法進一步包括鑒定能夠結合該生物樣品中的生物分子的該多個適體的序列。
32.如權利要求31所述的方法，其中鑒定能夠結合該生物樣品中的生物分子的該多個適體的序列包括下一代測序(ngs)。
33.如權利要求1-32中任一項所述的方法，該方法進一步包括鑒定與該多個適體結合的生物分子，該多個適體能夠結合該生物樣品中的生物分子。
34.如權利要求32或33所述的方法，該方法進一步包括將能夠結合該生物樣品中的生物分子的該多個適體的序列信息和/或與該多個適體結合的這些生物分子的信息編譯并存儲為計算機可讀格式。
35.一種適體數據庫，其包含通過如權利要求1-34中任一項所述的方法產生的一個或多個適體文庫的信息，其中每個適體文庫包含能夠結合生物樣品中的生物分子的適體。
36.一種用于分析靶生物樣品的靶適體文庫的方法，該方法包括：
37.如權利要求36所述的方法，其中步驟(ii)中的該第二適體數據庫是如權利要求35所述的適體數據庫。
38.如權利要求36或37所述的方法，其中該第一適體數據庫和該第二適體數據庫是相同的。
39.如...
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