【技術實現步驟摘要】
本專利技術提供了一種基于雙色熒光銀納米簇檢測牛奶中卡那霉素和妥布霉素的熒光傳感器，屬于食品安全檢測領域。
技術介紹
1、卡那霉素kan和妥布霉素tob都屬于氨基糖苷類抗生素，它們因為其廣泛的抗菌譜和強大的抗菌活性而被廣泛應用于治療奶牛的乳腺炎和各種細菌感染的治療。但其使用不當造成牛奶中的殘留，會對人體造成耳毒性、腎毒性以及神經肌肉阻滯等危害。
2、目前現存的對于kan和tob的傳統檢測方法包括：液相色譜串聯質譜法、酶聯免疫吸附法以及液相色譜-蒸發光散射檢測法等，這些方法有著操作較為復雜、需要專業人員操作、儀器較為昂貴以及成本較高等缺點。針對這些缺點，需要開發一種高效、簡便、便宜的對kan和tob的檢測方法。
3、熒光傳感器對比其他的策略與方法，有著靈敏度高、選擇性好、操作簡單、成本較低以及生物相容性較好。而通過agncs進行熒光檢測的方法，有著熒光強度和位置可調控、熒光壽命較好、具有良好的光穩定性和化學穩定性，這些性質都有利于傳感器的構建以及其更多目標物的傳感檢測。
4、碳12間臂c12?spacer中間修飾物寡核苷酸合成中常用的修飾，它由12個碳原子組成，用于在寡核苷酸和修飾基團之間引入一定的間隔。這種間隔有助于減少空間位阻，避免修飾基團與寡核苷酸之間的不利相互作用，增加分子的柔性，通過這種方式可以讓dna鏈結構減少不利的折疊旋轉。并且在猝滅時能夠盡可能減小兩個團簇之間的交叉反應和影響。
技術實現思路
1、專利技術的目的在于需求一種高效、便捷、
2、其技術方案為：適配體具有靈敏度高、特異性強的優點，常用于作為生物傳感器的感應元件進行使用和構建。熒光適配體傳感器方法對比其他傳感器有著靈敏度高、選擇性好等優點。納米金屬團簇具有著信號強度好、制備方法簡單、響應速度快等優點。但是多種金屬團簇熒光信號容易彼此之間發生信號重疊與干擾，以及信號變化時容易發生交叉反應。因此對銀納米簇agncs模板進行篩選以及利用c12?spacer對其進行修飾，避免了信號的重疊以及多熒光之間的交叉反應。
3、所述的一種基于雙色熒光銀納米簇檢測牛奶中卡那霉素和妥布霉素的熒光傳感器（圖1），其特征在于：該傳感器利用兩種具有紅色、黃色熒光的agncs分別作為檢測tob和kan的輸出信號。每種團簇模板片段與對應適配體片段鏈接后，再利用c12?spacer將他們兩組分別相連構成了所用了的dna鏈。利用還原法生成了兩種分別具有黃色和紅色熒光的agncs，分別在波長570?nm和677?nm出峰。當kan或tob存在時，會與dna序列的適配體片段進行識別和結合，影響其結構與構象，進而對其附近的agncs產生了猝滅效果，對應的熒光強度下降，實現了對kan和tob的檢測。
4、所述的一種基于雙色熒光銀納米簇檢測牛奶中卡那霉素和妥布霉素的熒光傳感器，其特征在于：在一條dna鏈上合成兩種熒光agncs和含有兩個適配體片段，易發生兩種信號的重疊以及猝滅過程中的信號的交叉反應的缺點。在dna鏈合成的過程中利用中間修飾基團對其進行間隔修飾，使其盡可能避免dna鏈的彎曲或折疊，保持穩定的鏈狀結構有了利于agncs在模板上的合成，熒光強度更高。同時對候選模板鏈進行測定和篩選，選用了信號良好沒有重疊的模板序列合成agncs，避免了信號的干擾。
5、其制備原理為：利用所合成的dna序列，我們設計了一種基于兩種熒光顏色的agncs和dna鏈結構構象變化對團簇熒光猝滅方案的熒光傳感器來檢測牛奶中的kan與tob。kan和tob的適配體片段分別與黃色和紅色銀納米簇的模板片段靠近，當kan或tob與適配體片段結合時會造成dna序列的結構和構象的變化，造成對應團簇熒光猝滅，信號下降。
6、為達到以上目的，采取以下技術方案實現：dna-銀納米簇dna-agncs的制備，按照合成公司的規定，首先用1×te緩沖液（ph?5.0-8.0）將dna鏈稀釋到濃度為100?μm。用1：7.8的dna與te緩沖液固定比例進一步調整與稀釋。在稀釋后的dna溶液中加入硝酸銀（2?mm），并最終dna（100?μm）：硝酸銀：硼氫化鈉物質的量濃度比為1：12：12。隨后，將溶液在混勻器上充分混勻1?min，以確保充分混合。將混勻后的溶液密封，避光條件下在冰水中孵育30min。隨后，制備新的硼氫化鈉溶液（2?mm）：將0.038?g的硼氫化鈉溶于10?ml超純水中配置成100?mm的硼氫化鈉溶液，再進一步稀釋為濃度為2?mm的硼氫化鈉溶液。將新制備的硼氫化鈉溶液（2?mm）加入到混合物中，立即對其充分混勻1?min。然后在室溫避光條件下孵育4小時。最后，在4℃的避光條件下保存過夜。
7、為達到以上目的，采取以下技術方案實現：制備適當濃度的kan和tob用于檢測與標曲。將50?μl的dna-agncs（10?μm）溶液加入到200?μl的超純水中。隨后，在該溶液中加入50?μl不同濃度的kan和tob，在室溫下避光反應約2?min，以實現競爭性結合。待反應結束，用熒光分光光度計測量熒光強度。在kan檢測中，以480?nm波長的激發光進行激發，并收集在500-655nm之間的發射光譜，其在570?nm左右有一個明顯的峰，與kan適配體模板的agncs相對應。對于tob的檢測，以600?nm波長的激發光進行激發，并收集在620-700?nm之間的發射光譜，其在677?nm左右有一個明顯的峰，與tob適配體模板的agncs相對應。熒光強度的差值與未加抗生素的空白對照進行比較。
8、所述適配體傳感器的制備工藝如下：牛奶樣品是從當地市場購買的。在樣品預處理前，將1、2、3?nm濃度的kan以及2、5、7?nm濃度的tob加入到牛奶樣品中，再對其進行蛋白質和脂肪的去除。首先，將每個添加的牛奶樣品4?ml加入16?ml的冰甲醇中，在-20℃下保存20?min。然后以12000?rpm離心15?min以去除沉淀。取上清液用0.22?μm膜進行過濾，濾液在60℃下干燥，殘余液再用氮氣進一步干燥。所得到的殘渣用超純水重溶，并再次通過0.22?μm濾膜過濾。最后，用超純水定容至4?ml。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種基于雙色熒光銀納米簇檢測牛奶中卡那霉素和妥布霉素的熒光傳感器，其特征在于：利用碳12間臂將卡那霉素、妥布霉素適配體片段鏈接到雙色銀納米簇模板序列與模板還原法合成了具有雙色熒光特性的銀納米簇來構建了一種熒光適配體傳感器，可用于牛奶中卡那霉素和妥布霉素的檢測。
2.如權利要求1中所述的一種基于雙色熒光銀納米簇檢測牛奶中卡那霉素和妥布霉素的熒光傳感器，其特征在于：利用碳12間臂將多個適配體片段與多色銀納米簇片段進行鏈接，使其在一定程度上，避免了序列過長引起的折疊旋轉，進而銀納米簇合成更多，熒光強度更強。并且在猝滅時，使得兩個熒光之間的交叉分析更小。有利于兩種靶標的準確檢測。
3.如權利要求1中所述的一種基于雙色熒光銀納米簇檢測牛奶中卡那霉素和妥布霉素的熒光傳感器，其特征在于：篩選測試并選擇了恰當雙色銀納米簇模板，使得合成的銀納米簇分別在570?nm和677?nm處產生熒光，彼此之間沒有交叉和重疊，為實現多重檢測提供了基礎。
4.如權利要求1中所述的一種基于雙色熒光銀納米簇檢測牛奶中卡那霉素和妥布霉素的熒光傳感器，其特征在于：利用了卡那霉素、妥
...【技術特征摘要】
1.一種基于雙色熒光銀納米簇檢測牛奶中卡那霉素和妥布霉素的熒光傳感器，其特征在于：利用碳12間臂將卡那霉素、妥布霉素適配體片段鏈接到雙色銀納米簇模板序列與模板還原法合成了具有雙色熒光特性的銀納米簇來構建了一種熒光適配體傳感器，可用于牛奶中卡那霉素和妥布霉素的檢測。
2.如權利要求1中所述的一種基于雙色熒光銀納米簇檢測牛奶中卡那霉素和妥布霉素的熒光傳感器，其特征在于：利用碳12間臂將多個適配體片段與多色銀納米簇片段進行鏈接，使其在一定程度上，避免了序列過長引起的折疊旋轉，進而銀納米簇合成更多，熒光強度更強。并且在猝滅時，使得兩個熒光之間的交叉分析更小。有利于兩種靶標的準確檢測。
3....
【專利技術屬性】
技術研發人員：李發蘭，尹艷皓，田宇航，孫霞，郭業民，
申請(專利權)人：山東理工大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。