【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
技術介紹
1、急性心肌梗塞(mi)仍然是全世界發病率和死亡率的主要原因之一。急性mi由冠狀動脈的血栓性閉塞介導，其導致非灌注組織中的進行性細胞死亡。這觸發炎癥應答，其導致疤痕形成和活體組織喪失。左心室中的組織構造的嚴重改變可以引起心室擴張、收縮功能障礙和心力衰竭。被命名為骨髓源性生長因子(mydgf)的蛋白質已顯示為改善mi的嚙齒類動物模型中的組織修復和心臟功能。與野生型小鼠相比，mydgf缺陷型小鼠發展更大的梗塞疤痕和更嚴重的收縮功能障礙。發現了用重組mydgf的治療能夠在急性mi后保護心肌細胞免于細胞死亡并修復心臟。基于蛋白質的療法的開發將是一種有前途的用于心臟修復和潛在地還用于其它組織中的缺血性修復的方法(ebenhoch等人，2019；polten等人，2019；botnov等人，2018，korf-klingebiel等人，2015，wo?2014/111458)。
2、目前，通過在人或哺乳動物表達系統例如hek-293t或cho細胞中表達來生產少量的重組人mydgf。然而，重組人mydgf(rhmydgf)通過哺乳動物細胞表達系統的大規模生產與高成本相關，這從經濟角度來看使得生產缺乏吸引力。已嘗試在細菌表達系統中生產rhmydgf。zhao等人，2020描述了具有c末端his標簽的可溶性rhmydgf在大腸桿菌(e.coli)中的表達。加上標簽的蛋白質與成熟的人野生型蛋白的不同之處在于9個額外的氨基酸，從而具有顯著更高的分子量。盡管作者在該出版物中推測該表達系統可能被用于生產rhmydgf用于臨床用途，
3、還已知rhmydgf的異源表達與相當大的降解問題相關。在蛋白質的重組表達后，定位在n末端處的一個或多個氨基酸被降解，其導致與全長蛋白質相比具有更小分子量(mw)的蛋白質片段。例如，zhao等人，2020描述了最終表達產物不僅包含mw為17032da的全長rhmydgf蛋白，還包含mw為約16900da的降解產物。zhao等人，2020中的靶蛋白對降解蛋白的比率為大約10:1，如可以從zhao出版物的圖2中所示的高效液相層析-質譜法(hplc-ms)數據獲得的。因此，通過降解產物的雜質是相當顯著的，并且對于預期用于系統性醫學用途的蛋白質是無法接受的。
4、鑒于上文闡述的現有技術，本專利技術的一個目的是提供具有mydgf活性的重組蛋白質，其
5、(i)在異源表達系統中表達時并不顯示出降解或僅顯示出最小的降解；
6、(ii)可以伴隨最小程度的潛在不利過程衍生的翻譯后修飾而生產，所述翻譯后修飾例如氨甲酰化和葡糖酰化(gluconoylation)，其可能不利于蛋白質的預期臨床用途；
7、(iii)具有天然人mydgf蛋白的二級結構和三級結構；
8、(iv)具有高生物活性；
9、(v)與除人mydgf外的一級序列衍生的抗原表位的低風險相關，從而產生最小風險的抗藥物抗體；
10、(vi)可以在原核表達系統中生產，以提供非糖基化產物；
11、(vii)可以以多于0.5g蛋白質/100g細胞的量產生，并且可擴展到多于100g、優選多于200g、更優選多于300g蛋白質/分批。
12、并非所有目標都將通過本專利技術的所有實施方案來實現。本專利技術的范圍由權利要求限定。然而，優選滿足本專利技術的前述目標中的2、3、4、5或6個。
技術實現思路
1、在第一方面，本專利技術涉及用于在宿主細胞中重組表達mydgf蛋白的方法。
2、在第二方面，本專利技術涉及可從本專利技術的第一方面的方法獲得的組合物。
3、在第三方面，本專利技術涉及本專利技術的第二方面的組合物用于制備藥物組合物的用途。
4、在第四方面，本專利技術涉及包含本專利技術的第二方面的組合物的藥物組合物。
5、在第五方面，本專利技術涉及本專利技術的第四方面的藥物組合物，其用作藥劑。
6、在第六方面，本專利技術涉及本專利技術的第二方面的組合物或本專利技術的第四方面的藥物組合物，其用于以下的方法中：(i)治療或預防選自以下的疾病或病況：損害、創傷、缺血、再灌注損傷、外傷、機械過載、中毒、手術、原發性或獲得性心肌病、缺血后收縮功能障礙、心肌梗塞優選急性心肌梗塞、心絞痛、心力衰竭、心臟炎癥、心功能不全、肥大和纖維化；(ii)促進或改善心肌梗塞后的心臟組織再生、心肌細胞增殖、新生血管形成、心臟功能或左心室收縮功能；(iii)保護心肌細胞免于例如通過細胞凋亡或壞死的死亡；或(iv)減少心肌梗塞優選急性心肌梗塞后的梗塞面積。
7、在第七方面，本專利技術涉及具有seq?id?no:1或seq?id?no:2并且優選具有seq?idno:1的氨基酸序列的蛋白質。
8、在第八方面，本專利技術涉及編碼本專利技術的第七方面的蛋白質的核酸。
9、在第九方面，本專利技術涉及包含本專利技術的第八方面的核酸的載體。
10、在第十方面，本專利技術涉及包含本專利技術的第七方面的蛋白質、本專利技術的第八方面的核酸或本專利技術的第九方面的載體的宿主細胞。
11、在第十一方面，本專利技術涉及包含本專利技術的第七方面的蛋白質的藥物組合物。
12、在第十二方面，本專利技術涉及本專利技術的第七方面的蛋白質或本專利技術的第十一方面的藥物組合物，其用作藥劑。
13、在第十三方面，本專利技術涉及本專利技術的第七方面的蛋白質或本專利技術的第十一方面的藥物組合物，其用于以下的方法中：(i)治療或預防選自以下的疾病或病況：損害、創傷、缺血、再灌注損傷、外傷、機械過載、中毒、手術、原發性或獲得性心肌病、缺血后收縮功能障礙、心肌梗塞優選急性心肌梗塞、心絞痛、心力衰竭、心臟炎癥、心功能不全、肥大和纖維化；(ii)促進或改善心肌梗塞后的心臟組織再生、心肌細胞增殖、新生血管形成、心臟功能或左心室收縮功能；(iii)保護心肌細胞免于例如通過細胞凋亡或壞死的死亡；或(iv)減少心肌梗塞優選急性心肌梗塞后的梗塞面積。
14、在第十四方面，本專利技術涉及用于在宿主細胞中重組表達本專利技術的第七方面的蛋白質的方法。
15、在第十五方面，本專利技術涉及可從本專利技術的第十四方面的方法獲得的組合物。
16、最后，在第十六方面，本專利技術涉及本專利技術的第十方面的宿主細胞用于重組表達mydgf蛋白的用途。
17、專利技術詳述
18、本專利技術提供了這樣的蛋白質，其具有mydgf活性，并且在宿主細胞中重組表達時實現最小程度的降解和過程衍生的翻譯后修飾。本專利技術還提供了用于在基于細胞的表達系統中大量生產這些蛋白質的方法。該方法需要顯著降低的純化努力，用于提供適合于被配制成藥物產品的均質蛋白質組合物。如果在下文中提及seq?id?no:1或seq?id?no:2，則必須理解seq?id?no:1是優選的備選方案。
19、本文在本專利技術的上下文中公開的蛋白質在seq?id?no:1和seq?id?no:2中進行描繪。兩種蛋白本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.用于在宿主細胞中重組表達MYDGF蛋白的方法，其包括
2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(a)包括
3.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中步驟(a)包括提供包含SEQ?ID?NO:7或SEQ?ID?NO:8的核酸且優選SEQ?ID?NO:7的核酸的宿主細胞。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述成熟是N末端甲硫氨酸殘基的去除。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述N末端甲硫氨酸殘基的去除是通過一種或多種宿主細胞衍生的氨肽酶來實現的。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其進一步包括(e)在步驟(d)之后獲得具有SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列的143個氨基酸且優選具有SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列的143個氨基酸的重折疊MYDGF蛋白。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中步驟(d)中的蛋白質重折疊包括在尿素的存在下的蛋白質溫育。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括(f)純化所述MYDGF蛋
9.根據權利要求8所述的方法，其中步驟(f)包括超濾、滲濾、疏水相互作用層析和/或陰離子交換層析。
10.根據權利要求9所述的方法，其中陰離子交換層析或疏水相互作用層析步驟通過以下執行：在允許所述MYDGF蛋白吸附至樹脂的條件下使所述MYDGF蛋白與層析樹脂材料接觸，任選地洗滌所述樹脂，并且從樹脂中洗脫所述MYDGF蛋白。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述MYDGF蛋白與所述陰離子交換層析樹脂的吸附是在低離子強度的條件下執行的。
12.根據權利要求11所述的方法，其中吸附是在小于3mS/cm、小于2mS/cm、小于1.5mS/cm或小于1mS/cm的電導率下執行的。
13.根據權利要求9-12中任一項所述的方法，其中通過增加鹽濃度和/或降低液相的pH來實現所述MYDGF蛋白從所述陰離子交換樹脂中的解吸附。
14.根據權利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是原核宿主細胞。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述原核宿主細胞是細菌細胞。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述細菌宿主細胞是大腸桿菌細胞。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述大腸桿菌細胞是菌株BL21或其衍生菌株的大腸桿菌細胞。
18.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述核酸包含SEQ?ID?NO:11或SEQ?ID?NO:12的序列。
20.根據權利要求1-19中任一項所述的方法，其中所述核酸包含在載體中。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述載體是原核表達載體。
22.根據權利要求20或21所述的方法，其中所述載體包含T7啟動子。
23.根據權利要求20-22中任一項所述的方法，其中所述載體包含SEQ?ID?NO:7或SEQID?NO:8的序列，或者由SEQ?ID?NO:7或SEQ?ID?NO:8的序列組成。
24.可根據權利要求1-23中任一項所述的方法獲得的組合物，其中所述組合物包含具有SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的氨基酸序列的143個氨基酸的蛋白質。
25.根據權利要求24所述的組合物，其中所述組合物包含小于1％(w/w)的短于143個氨基酸的蛋白質分子，如通過液相層析質譜法(LCMS)測量的。
26.根據權利要求24或25所述的組合物，其中所述組合物包含小于20pg，優選小于15pg/mg，更優選小于10pg/mg，且最優選小于5pg/mg、小于3pg/mg、小于2pg/mg或小于1pg/mg宿主細胞DNA。
27.根據權利要求24-26中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含小于0.2EU/mg，且優選小于0.1EU/mg或0.08EU/mg細菌內毒素。
28.根據權利要求24-27中任一項所述的組合物，其中所述組合物中小于8％(w/w)，且優選小于7％(w/w)、小于6％(w/w)或小于5％(w/w)、小于4％(w/w)、小于3％(w/w)或小于2％(w/w)的蛋白質是氨甲酰化的。
29.根據權利要求24-28中任一項所述的組合物，其中所述組合物中小于6％(w/w)，且優選小于5％(w/w)、小于4％(w/w)或小于3％(w/w)或小于2％(w/w)的蛋白質是葡糖酰化的。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.用于在宿主細胞中重組表達mydgf蛋白的方法，其包括
2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(a)包括
3.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中步驟(a)包括提供包含seq?id?no:7或seq?id?no:8的核酸且優選seq?id?no:7的核酸的宿主細胞。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述成熟是n末端甲硫氨酸殘基的去除。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述n末端甲硫氨酸殘基的去除是通過一種或多種宿主細胞衍生的氨肽酶來實現的。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其進一步包括(e)在步驟(d)之后獲得具有seq?id?no:1或seq?id?no:2的氨基酸序列的143個氨基酸且優選具有seq?id?no:1的氨基酸序列的143個氨基酸的重折疊mydgf蛋白。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中步驟(d)中的蛋白質重折疊包括在尿素的存在下的蛋白質溫育。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括(f)純化所述mydgf蛋白。
9.根據權利要求8所述的方法，其中步驟(f)包括超濾、滲濾、疏水相互作用層析和/或陰離子交換層析。
10.根據權利要求9所述的方法，其中陰離子交換層析或疏水相互作用層析步驟通過以下執行：在允許所述mydgf蛋白吸附至樹脂的條件下使所述mydgf蛋白與層析樹脂材料接觸，任選地洗滌所述樹脂，并且從樹脂中洗脫所述mydgf蛋白。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述mydgf蛋白與所述陰離子交換層析樹脂的吸附是在低離子強度的條件下執行的。
12.根據權利要求11所述的方法，其中吸附是在小于3ms/cm、小于2ms/cm、小于1.5ms/cm或小于1ms/cm的電導率下執行的。
13.根據權利要求9-12中任一項所述的方法，其中通過增加鹽濃度和/或降低液相的ph來實現所述mydgf蛋白從所述陰離子交換樹脂中的解吸附。
14.根據權利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是原核宿主細胞。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述原核宿主細胞是細菌細胞。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述細菌宿主細胞是大腸桿菌細胞。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述大腸桿菌細胞是菌株bl21或其衍生菌株的大腸桿菌細胞。
18.根據權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述核酸是dna或rna。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述核酸包含seq?id?no:11或seq?id?no:12的序列。
20.根據權利要求1-19中任一項所述的方法，其中所述核酸包含在載體中。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述載體是原核表達載體。
22.根據權利要求20或21所述的方法，其中所述載體包含t7啟動子。
23.根據權利要求20-22中任一項所述的方法，其中所述載體包含seq?id?no:7或seqid?no:8的序列，或者由seq?id?no:7或seq?id?no:8的序列組成。
24.可根據權利要求1-23中任一項所述的方法獲得的組合物，其中所述組合物包含具有seq?id?no:1或seq?id?no:2的氨基酸序列的143個氨基酸的蛋白質。
25.根據權利要求24所述的組合物，其中所述組合物包含小于1％(w/w)的短于143個氨基酸的蛋白質分子，如通過液相層析質譜法(lcms)測量的。
26.根據權利要求24或25所述的組合物，其中所述組合物包含小于20pg，優選小于15pg/mg，更優選小于10pg/mg，且最優選小于5pg/mg、小于3pg/mg、小于2pg/mg或小于1pg/mg宿主細胞dna。
27.根據權利要求24-26中任一項所述的組合物，其中所述組合物包含小于0.2eu/mg，且優選小于0.1eu/mg或0.08eu/mg細菌內毒素。
28.根據權利要求24-27中任一項所述的組合物，其中所述組合物中小于8％(w/w)，且優選小于7％(w/w)、小于6％(w/w)或小于5％(w/w)、小于4％(w/w)、小于3％(w/w)或小于2％(w/w)的蛋白質是氨甲酰化的。
29.根據權利要求24-28中任一項所述的組合物，其中所述組合物中小于6％(w/w)，且優選小于5％(w/w)、小于4％(w/w)或小于3％(w/w)或小于2％(w/w)的蛋白質是葡糖酰化的。
30.根據權利要求24-29中任一項所述的組合物，其中本發明的所述組合物中小于8％且優...
【專利技術屬性】
技術研發人員：M·伯克邁耶，A·皮可斯克，P·古普塔，J·雷德，M·科爾夫克林貝勒，C·沃爾特，K·C·沃勒特，
申請(專利權)人：勃林格殷格翰國際有限公司，
類型：發明
國別省市：
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