【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，尤其涉及具有三螺旋結構的重組人源化ⅲ型膠原蛋白及其應用。
技術介紹
1、膠原蛋白占到人體蛋白質總量的25％～30％，28種膠原蛋白中i型、ii型、iii型占比為90％。人iii型膠原蛋白是由三條alpha鏈螺旋形成的纖維蛋白，成熟后的iii型膠原蛋白每條蛋白鏈含有1068個氨基酸，三條蛋白鏈形成三螺旋分子量接近400kda。在作為護膚品成分之一時，膠原蛋白天然的膠束結構和大分子量特性，使其不易透過皮膚屏障到達真皮層發揮作用。iii型膠原蛋白上含有多個信號通路識別位點，如和整合素識別位點結合激活膠原蛋白的重生。iii型膠原蛋白的氨基酸序列為一段重復序列gly-x-y，x與y可以是任意氨基酸，但x通常是脯氨酸(pro)，y通常是羥脯氨酸(hyp)與羥賴氨酸(hyl)，而hyp與hyl需要羥化酶進行修飾得到。
2、據報道，具有三螺旋結構的膠原蛋白比單鏈膠原蛋白具有更好的穩定性、生物相容性和細胞增殖活性等。但目前重組膠原蛋白三螺旋結構的形成主要依賴于序列和不同來源的羥化酶之間的匹配，鮮有報道能夠自主組裝成三螺旋的重組膠原蛋白。
技術實現思路
1、本專利技術的第一目的在于提供一種分子量比天然膠原蛋白小且具有三螺旋結構的重組人源化ⅲ型膠原蛋白。本專利技術通過對人ⅲ型膠原蛋白成熟區序列的篩選，獲得其核心序列，并通過重復，得到能夠在體外自組裝為三螺旋的序列。
2、本專利技術所述重組人源化ⅲ型膠原蛋白核心序列的氨基酸序列與seq?idno.1所示的序列同源
3、關于氨基酸序列同源性，一方面是基于保守氨基酸取代，這種保守性使得結構相關氨基酸類似地取代某氨基酸而不會對所得變體多肽的性質產生大的影響，例如是其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基取代。另一方面，考慮到在seq?id?no.1基礎上增添一段或多段冗余序列，而這種改變未帶來生物活性明顯增加、結構更穩定的現象，即原來的生物活性片段不會因為冗余序列的介入而更好地發揮生物學功能如與受體結合的能力。因此，落入本專利技術范圍內的氨基酸改變是通過選擇其對維持生物作用顯著提高的改變來實現的。
4、本專利技術所述重組人源化ⅲ型膠原蛋白核心序列重復串聯形成能夠在體外自組裝為三螺旋的序列。
5、優選地，重復次數為4-16，更優選地，重復次數為7、8、9；最優選地，重復次數為8。
6、所述的重復串聯可以是核心單元頭尾相串聯，還可以是由連接子(linker)將核心單元串聯起來，所述連接子優選含有甘氨酸(gly)和/或絲氨酸(ser)，所述連接子優選含有1-5個氨基酸。
7、本專利技術重組膠原蛋白可以帶有一個或多個組氨酸組成的標簽。所述標簽連接至重組膠原蛋白n端或c端。所述標簽可用于通過使用基于鎳的色譜介質的色譜方法來純化蛋白質。
8、更優選地，在所述重組人源化ⅲ型膠原蛋白n端保留ala和lys兩個氨基酸(對應人ⅲ型膠原蛋白成熟區第286-287位)得到，能夠使目的蛋白的結構穩定性進一步提高。
9、最優選地，本專利技術重組人源化ⅲ型膠原蛋白的氨基酸序列如seq?idno.2所示。該序列是由核心序列(seq?id?no.1)重復串聯8次，并且在n端保留ala和lys兩個氨基酸。
10、所述人ⅲ型膠原蛋白成熟區請見ncbi?refseq:np_000081.2，mat_peptide154..1221，/product＝"collagenalpha-1(iii)chain"。
11、本專利技術提供了編碼所述的重組人源化ⅲ型膠原蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列與seq?id?no.3的核苷酸序列有80％以上同源性；優選地，所述基因的核苷酸序列與seqid?no.3的核苷酸序列有90％以上同源性；最優選地，所述基因的核苷酸序列如seq?idno.3所示。
12、關于核苷酸序列同源性，一方面是由于存在密碼子的簡并性，導致編碼蛋白的核苷酸序列并不唯一，因此能夠編碼產生本專利技術重組人源化ⅲ型膠原蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，均在本專利技術的保護范圍內。
13、本專利技術提供了表達所述的重組人源化ⅲ型膠原蛋白的重組載體，包括初始載體和所述的基因。
14、載體包括衍生自任何來源并且能夠基因組整合或自主復制的任何核酸分子(例如質粒、粘粒、病毒、自主復制的多核苷酸分子、噬菌體、或線性或環狀單鏈或雙鏈dna或rna核酸分子)，其包含已可操作連接的一種或更多種核酸分子的核酸分子。載體可以包括，例如一個或多個可選擇的標記物、一個或多個復制起點(例如原核和真核起點)、至少一個多克隆位點、和/或促進構建體穩定整合到宿主細胞基因組中的元件。
15、本專利技術提供了表達所述的重組人源化ⅲ型膠原蛋白的重組細胞，所述重組細胞中轉染有所述的重組載體。
16、所述重組細胞優選為畢赤酵母gs115。
17、本專利技術的第二目的是提供所述重組人源化ⅲ型膠原蛋白表達的方法，優選為在畢赤酵母gs115中表達的方法，包括以下步驟：
18、i)將目的片段通過克隆組裝至載體質粒上，轉化至大腸桿菌jm109中擴增，抽提質粒；
19、ii)用快切酶saci對質粒ppiczαa進行線性化，電轉化至畢赤酵母gs115，使用ypd抗性平板進行初篩和復篩；
20、iii)將轉化子挑取至bmgy培養基中，培養后離心棄上清；使用bmmy培養基將菌體重懸，誘導培養；培養液經分離純化得到目的蛋白。
21、優選地，使用ypd抗性平板進行初篩和復篩是指使用100μg/ml的ypd抗性平板進行初步篩選，800μg/ml的ypd抗性平板進行復篩。
22、優選地，所述的誘導培養是使用1％的甲醇，每24小時補加一次，共計誘導培養96小時。
23、本專利技術的第三個目的是提供所述的重組ⅲ型膠原蛋白、所述制備方法制備獲得的重組ⅲ型膠原蛋白包括有以下任一項中的應用：
24、i)促進細胞增殖；
25、ii)促進細胞遷移；
26、iii)制備化妝品；
27、iv)制備醫用材料。
28、所述的化妝品包括但不限于護膚液、護膚霜、精華水、面膜、頭皮精華液、洗發露。
29、所述的醫用材料包括但不限于填充材料、修復材料、植入劑、組織工程支架、止血劑、藥物釋放載體，其中修復材料包括但不限于骨修復材料、創面敷料、縫合線。
30、本專利技術還提供一種包括美容上或藥學上有效量的至少一種根據前述的蛋白以及至少一種賦形劑或美容上或藥學上可接受的佐劑的組合物。在一些實施方式中，所述組合物的劑型包括但不限于膏霜、乳液、水劑、凝膠、油劑、粉劑、泥類、貼類、膜類或凍干類；進一步地，為了促進膠原蛋白分子透皮吸收，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種重組人源化Ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列包括n個核心單元，其中n是1或大于1的整數，所述核心單元的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
2.根據權利要求1所述的重組Ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，所述n選自4-16中的任一個整數。
3.根據權利要求1所述的重組人源化Ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，所述的重組人源化Ⅲ型膠原蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。
4.編碼權利要求1所述的重組人源化Ⅲ型膠原蛋白的基因。
5.表達權利要求1所述的重組人源化Ⅲ型膠原蛋白的重組載體，其特征在于，包括權利要求4所述的基因。
6.表達權利要求1所述的重組人源化Ⅲ型膠原蛋白的重組細胞，其特征在于，所述重組細胞中轉染有權利要求5所述的重組載體。
7.權利要求1所述的重組人源化Ⅲ型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的載體質粒為pPICZαA，所述的大腸桿菌為大腸桿菌JM109，所述的快切酶為酶SacI，所述的酵母為畢赤酵母GS115。
<...【技術特征摘要】
1.一種重組人源化ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列包括n個核心單元，其中n是1或大于1的整數，所述核心單元的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。
2.根據權利要求1所述的重組ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，所述n選自4-16中的任一個整數。
3.根據權利要求1所述的重組人源化ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，所述的重組人源化ⅲ型膠原蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
4.編碼權利要求1所述的重組人源化ⅲ型膠原蛋白的基因。
5.表達權利要求1所述的重組人源化ⅲ型膠原蛋白的重組載體，其特征在于，包括權利要求4所述的基因。
6.表達權利要求1所述的重組人源化ⅲ型膠原蛋白的重組細胞，其特征在于，所述重組細胞中轉染有權利要求5...
【專利技術屬性】
技術研發人員：石竟成，李艷，宋曉慧，徐俏冉，周云俠，張影，葛建敬，
申請(專利權)人：東莞恒醫生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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