【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及生物，尤其涉及一種gntr17基因缺失株m5δgntr17株及其構建方法與應用。
技術介紹
1、布魯菌病，簡稱“布病”，是一種重要的人獸共患細菌性傳染病，感染動物主要引起公畜睪丸或附睪炎，母畜流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎；感染人主要引起波浪熱以及各種并發(fā)癥。
2、布病在全世界廣泛流行和分布，據(jù)報道，全世界每年新增感染病例約50萬人，嚴重制約動物以及動物相關產(chǎn)品的國際貿(mào)易，給公共衛(wèi)生安全和社會經(jīng)濟發(fā)展造成巨大影響。布病在我國分布廣泛，總體呈現(xiàn)“北高南低”的流行趨勢。近二十年，由于動物飼養(yǎng)量增加、動物貿(mào)易和流通頻繁等因素，導致布病死灰復燃，發(fā)病率逐年升高，疫情呈現(xiàn)歷史高位水平，嚴重危害人民健康和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
3、布病的預防和控制主要依賴于檢疫撲殺和疫苗免疫。自二十世紀初以來，有關布病疫苗的研發(fā)工作就已開始，疫苗的研制經(jīng)歷了滅活疫苗、弱毒活疫苗、突變株疫苗以及新型疫苗的逐步演變。研究表明，布魯菌的弱毒活疫苗的保護效果顯著，要明顯優(yōu)于滅活疫苗。因此，為動物接種布魯菌弱毒活疫苗是有效控制布病流行的重要舉措之一。然而，目前臨床獸用布魯菌弱毒活疫苗存在一定缺陷，如弱毒疫苗株毒性大、返祖現(xiàn)象嚴重，會對人與動物機體造成一定的傷害，嚴重的會導致機體發(fā)病。另外，針對人布病并沒有有效的疫苗，而且在給動物接種弱毒活疫苗的過程中是有傳播給人的風險，因此，開發(fā)針對動物和人類安全有效的疫苗將是有效遏制布病流行的重中之重。
4、隨著分子生物學技術的發(fā)展和對布魯菌致病機制的深入了解，針對布魯菌病的新型基因工程疫苗有望取
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術的目的在于提供一種gntr17基因缺失株m5δgntr17株及其構建方法與應用，敲除gntr17基因后構建的m5δgntr17株比原始布魯菌m5株的毒力減弱，安全性高，可作為預防動物布魯菌病的候選減毒活疫苗菌株。
2、為了實現(xiàn)上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：
3、本專利技術提供了一種gntr17基因缺失株m5δgntr17株，所述m5δgntr17株為羊種布魯菌m5株缺失gntr17基因后得到，所述m5δgntr17株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期為：2024年7月4日，保藏編號為：cgmcc?no.46061。
4、本專利技術還提供了一種上所述m5δgntr17株的構建方法，包括如下步驟：
5、(1)pcr擴增gntr17基因上游同源臂片段和下游同源臂片段，擴增完成后將兩個片段融合，得到融合片段；
6、(2)將融合片段與線性化的自殺性質(zhì)粒pkb同源重組進行連接，得到連接產(chǎn)物，篩選得到自殺性質(zhì)粒pkb-δgntr17；
7、(3)將自殺性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至羊種布魯菌感受態(tài)細胞中，篩選得到m5δgntr17株。
8、進一步的，步驟(1)中，所述擴增gntr17基因上游同源臂片段所用引物組的序列為：seq?id?no:1所示的gntr17-uf和seq?id?no:2所示的gntr17-ur；擴增gntr17基因下游同源臂片段所用引物組的序列為：seq?id?no:3所示的gntr17-df和seq?id?no:4所示的gntr17-dr；所述融合使用的引物組為gntr17-uf和gntr17-dr。
9、進一步的，步驟(2)中，所述篩選的方法為：將步驟(2)的連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)至大腸桿菌dh5a感受態(tài)細胞中，依次經(jīng)含卡那霉素的lb平板和液體培養(yǎng)基篩選卡那霉素抗性菌株，然后進行菌液pcr鑒定，并提取pkb-δgntr17質(zhì)粒。
10、進一步的，步驟(3)中，所述篩選的方法為：將轉(zhuǎn)化后的羊種布魯菌感受態(tài)細胞接種于含卡那霉素的tsa平板，挑取單克隆細菌培養(yǎng)后，再經(jīng)過含蔗糖tsa平板進行負向篩選，挑取單克隆菌落，繼續(xù)培養(yǎng)后使用內(nèi)側(cè)鑒定引物和外側(cè)鑒定引物，pcr鑒定缺失株m5δgntr17株。
11、進一步的，所述內(nèi)側(cè)鑒定引物的序列為：seq?id?no.5所示的ingntr17-f和seq?idno.6所示的ingntr17-r；所述外側(cè)鑒定引物的序列為：seq?id?no.7所示的outgntr17-f和seq?id?no.8所示的outgntr17-r。
12、本專利技術還提供了一種gntr17基因缺失株m5δgntr17株在制備布魯菌弱毒活疫苗中的應用。
13、本專利技術所述的m5δgntr17株與現(xiàn)有技術相比的有益效果為：
14、(1)本專利技術發(fā)現(xiàn)，gntr17基因是影響布魯菌毒力的相關基因，gntr17基因缺失可減弱布魯菌的毒力，安全性提高，缺失后能顯著降低布魯菌在細胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)的存活能力，具有潛在的應用價值。
15、(2)敲除gntr17基因后構建的m5δgntr17株比原始布魯菌m5株的毒力減弱，安全性高，與m5-90δ26疫苗具有相似免疫保護性，可作為預防動物布魯菌病的候選減毒活疫苗菌株。
16、(3)本專利技術發(fā)現(xiàn)，gntr17基因缺失會影響布魯菌的基本表型，如低營養(yǎng)環(huán)境下生長速度變緩，抵抗免疫介質(zhì)殺傷的能力也顯著降低。
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1.一種gntR17基因缺失株M5ΔgntR17株，其特征在于，所述M5ΔgntR17株為羊種布魯菌M5株缺失gntR17基因后得到，所述M5ΔgntR17株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期為：2024年7月4日，保藏編號為：CGMCC?NO.46061。
2.一種權利要求1所述M5ΔgntR17株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權利要求2所述M5ΔgntR17株的構建方法，其特征在于，步驟(1)中，擴增gntR17基因上游同源臂片段所用引物組的序列為：SEQ?ID?NO:1所示的GntR17-UF和SEQ?ID?NO:2所示的GntR17-UR；擴增gntR17基因下游同源臂片段所用引物組的序列為：SEQ?ID?NO:3所示的GntR17-DF和SEQ?ID?NO:4所示的GntR17-DR；所述融合使用的引物組為GntR17-UF和GntR17-DR。
4.根據(jù)權利要求2所述M5ΔgntR17株的構建方法，其特征在于，步驟(2)中，所述篩選的方法為：將步驟(2
5.根據(jù)權利要求2所述M5ΔgntR17株的構建方法，其特征在于，步驟(3)中，所述篩選的方法為：將轉(zhuǎn)化后的羊種布魯菌感受態(tài)細胞接種于含卡那霉素的TSA平板，挑取單克隆細菌培養(yǎng)后，再經(jīng)過含蔗糖TSA平板進行負向篩選，挑取單克隆菌落，繼續(xù)培養(yǎng)后使用內(nèi)側(cè)鑒定引物和外側(cè)鑒定引物，PCR鑒定缺失株M5ΔgntR17株。
6.根據(jù)權利要求5所述M5ΔgntR17株的構建方法，其特征在于，所述內(nèi)側(cè)鑒定引物的序列為：SEQ?ID?NO.5所示的InGntR17-F和SEQ?ID?NO.6所示的InGntR17-R；所述外側(cè)鑒定引物的序列為：SEQ?ID?NO.7所示的OutGntR17-F和SEQ?ID?NO.8所示的OutGntR17-R。
7.一種權利要求1所述gntR17基因缺失株M5ΔgntR17株在制備布魯菌弱毒活疫苗中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種gntr17基因缺失株m5δgntr17株，其特征在于，所述m5δgntr17株為羊種布魯菌m5株缺失gntr17基因后得到，所述m5δgntr17株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期為：2024年7月4日，保藏編號為：cgmcc?no.46061。
2.一種權利要求1所述m5δgntr17株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權利要求2所述m5δgntr17株的構建方法，其特征在于，步驟(1)中，擴增gntr17基因上游同源臂片段所用引物組的序列為：seq?id?no:1所示的gntr17-uf和seq?id?no:2所示的gntr17-ur；擴增gntr17基因下游同源臂片段所用引物組的序列為：seq?id?no:3所示的gntr17-df和seq?id?no:4所示的gntr17-dr；所述融合使用的引物組為gntr17-uf和gntr17-dr。
4.根據(jù)權利要求2所述m5δgntr17株的構建方法，其特征在于，步驟(2)中，...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：田明星，楊新梅，王少輝，祁晶晶，鮑衍清，
申請(專利權)人：中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所中國動物衛(wèi)生與流行病學中心上海分中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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