【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及干細胞生物，尤其是涉及一種軟骨誘導培養(yǎng)基及其在骨髓干細胞來源的軟骨細胞制備中的應用。
技術介紹
1、因創(chuàng)傷、老齡化、骨關節(jié)炎引起的關節(jié)軟骨損傷嚴重影響關節(jié)及其周圍組織的生理結構與功能，導致關節(jié)疼痛和行動功能退變。作為第一代組織工程軟骨再生修復技術，自體軟骨細胞移植(autologous?chondrocyte?implantation,aci)是臨床治療早期關節(jié)軟骨損傷的有效方案，而aci供體細胞來源有限、體外擴增易導致軟骨細胞表型丟失、供體組織二次損傷等問題是aci技術臨床應用面臨的主要挑戰(zhàn)。骨髓來源的間充質干細胞(bonemarrow-derived?mesenchymal?stem?cells,bmscs)因其出色的自我更新和骨/軟骨分化能力，是自體或同種異體軟骨細胞移植的重要細胞來源。現階段，骨髓干細胞來源軟骨細胞的制備流程主要包括bmscs的原代分離擴增、誘導分化培養(yǎng)等過程，其中，bmscs原代分離純度低、體外擴增時間長、成軟骨誘導分化效率低等問題已成為骨髓干細胞來源軟骨細胞規(guī)模化制備及臨床轉化的主要瓶頸。
技術實現思路
1、為了縮短異體骨髓干細胞來源軟骨細胞制劑的體外制備周期，本專利技術的目的是提供一種軟骨誘導培養(yǎng)基及其在骨髓干細胞來源的軟骨細胞制備中的應用。
2、本專利技術中，軟骨細胞培養(yǎng)方法是指經全骨髓貼壁分離得到的間充質干細胞在體外純化擴增、誘導分化培養(yǎng)過程后形成具有軟骨細胞表型的種子細胞；所述軟骨誘導培養(yǎng)基是指在經典的軟骨誘導培養(yǎng)基中添
3、本專利技術的目的可以通過以下技術方案來實現：
4、本專利技術的第一個目的是提供一種軟骨誘導培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括dmem/f-12培養(yǎng)基、10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mmol/l丙酮酸鈉、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、40ng/ml地塞米松、50μg/ml?l-抗壞血酸、46μg/ml?l-脯氨酸、10ng/ml轉化生長因子-β1和2.5ng/ml～10ng/ml多烯紫杉醇。
5、在本專利技術的一個實施方式中，所述培養(yǎng)基包括dmem/f-12培養(yǎng)基、10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mmol/l丙酮酸鈉、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、40ng/ml地塞米松、50μg/ml?l-抗壞血酸、46μg/ml?l-脯氨酸、10ng/ml轉化生長因子-β1和2.5nmol/l多烯紫杉醇。
6、在本專利技術的一個實施方式中，所述培養(yǎng)基包括dmem/f-12培養(yǎng)基、10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mmol/l丙酮酸鈉、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、40ng/ml地塞米松、50μg/ml?l-抗壞血酸、46μg/ml?l-脯氨酸、10ng/ml轉化生長因子-β1和10nmol/l多烯紫杉醇。
7、本專利技術的第二個目的是提供一種軟骨誘導培養(yǎng)基在骨髓干細胞來源的軟骨細胞制備中的應用。
8、本專利技術的第三個目的是提供一種骨髓干細胞來源的軟骨細胞，其特征在于，利用上述軟骨誘導培養(yǎng)基制備得到。
9、本專利技術的第四個目的是提供一種骨髓干細胞來源的軟骨細胞的制備方法，包括以下步驟：
10、(s1)將骨髓全血稀釋液與percoll細胞分離液混勻后進行密度梯度離心，收集中間有核細胞層，然后利用干細胞生長培養(yǎng)基重懸中間有核細胞層并進行二維培養(yǎng)，待細胞匯合度達80％～90％后，進行傳代擴增培養(yǎng)，得到bmscs；
11、(s2)利用上述軟骨誘導培養(yǎng)基對步驟(s1)制備得到的bmscs進行誘導分化培養(yǎng)，制備得到骨髓干細胞來源的軟骨細胞。
12、在本專利技術的一個實施方式中，步驟(s1)中，骨髓全血稀釋液與percoll細胞分離液的體積比為0.8～1.2：1；
13、優(yōu)選地，骨髓全血稀釋液與percoll細胞分離液的體積比為1。
14、在本專利技術的一個實施方式中，步驟(s1)中，percoll細胞分離液的密度為1.017g/ml～1.073g/ml；
15、優(yōu)選地，percoll細胞分離液的密度為1.073g/ml。
16、在本專利技術的一個實施方式中，(s1)中，傳代擴增培養(yǎng)至第3代至第5代，得到bmscs；優(yōu)選地，傳代擴增培養(yǎng)至第3代；
17、其中，傳代擴增培養(yǎng)的代際細胞密度比例為1：2～1：4；優(yōu)選地，傳代擴增培養(yǎng)過程的代際細胞密度比例為1：2。
18、在本專利技術的一個實施方式中，步驟(s2)中，誘導分化培養(yǎng)過程中，所需的起始細胞密度為0.5×104cell/cm2～2×104cell/cm2；優(yōu)選地，所需的起始細胞密度為1×104cell/cm2。
19、與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
20、本專利技術提供的軟骨誘導培養(yǎng)基能夠顯著提高bmscs的成軟骨分化效率，有助于縮短骨髓干細胞來源軟骨細胞的體外制備周期，最大程度地避免干細胞體外培養(yǎng)過程中軟骨細胞表型的丟失，對于軟骨細胞移植的制劑研發(fā)與臨床轉化具有重要的應用價值。
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1.一種軟骨誘導培養(yǎng)基，其特征在于，包括DMEM/F-12培養(yǎng)基、10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1mmol/L丙酮酸鈉、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、40ng/mL地塞米松、50μg/mL?L-抗壞血酸、46μg/mL?L-脯氨酸、10ng/mL轉化生長因子-β1和2.5ng/mL～10ng/mL多烯紫杉醇。
2.根據權利要求1所述的一種軟骨誘導培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括DMEM/F-12培養(yǎng)基、10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1mmol/L丙酮酸鈉、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、40ng/mL地塞米松、50μg/mL?L-抗壞血酸、46μg/mL?L-脯氨酸、10ng/mL轉化生長因子-β1和2.5nmol/L多烯紫杉醇。
3.根據權利要求1所述的一種軟骨誘導培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括DMEM/F-12培養(yǎng)基、10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1mmol/L丙酮酸鈉、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、40ng/mL地塞米松、50μg/mL?L-抗壞
4.一種如權利要求1～3任一所述的軟骨誘導培養(yǎng)基在骨髓干細胞來源的軟骨細胞制備中的應用。
5.一種骨髓干細胞來源的軟骨細胞，其特征在于，利用權利要求1～3任一所述的軟骨誘導培養(yǎng)基制備得到。
6.一種骨髓干細胞來源的軟骨細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.根據權利要求6所述的一種骨髓干細胞來源的軟骨細胞的制備方法，其特征在于，步驟(S1)中，骨髓全血稀釋液與Percoll細胞分離液的體積比為0.8～1.2：1。
8.根據權利要求7所述的一種骨髓干細胞來源的軟骨細胞的制備方法，其特征在于，Percoll細胞分離液的密度為1.017g/mL～1.073g/mL。
9.根據權利要求6所述的一種骨髓干細胞來源的軟骨細胞的制備方法，其特征在于，步驟(S1)中，傳代擴增培養(yǎng)至第3代至第5代，得到BMSCs，
10.根據權利要求6所述的一種骨髓干細胞來源的軟骨細胞的制備方法，其特征在于，步驟(S2)中，誘導分化培養(yǎng)過程中，起始細胞密度為0.5×104cell/cm2～2×104cell/cm2。
...【技術特征摘要】
1.一種軟骨誘導培養(yǎng)基，其特征在于，包括dmem/f-12培養(yǎng)基、10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mmol/l丙酮酸鈉、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、40ng/ml地塞米松、50μg/ml?l-抗壞血酸、46μg/ml?l-脯氨酸、10ng/ml轉化生長因子-β1和2.5ng/ml～10ng/ml多烯紫杉醇。
2.根據權利要求1所述的一種軟骨誘導培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括dmem/f-12培養(yǎng)基、10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mmol/l丙酮酸鈉、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、40ng/ml地塞米松、50μg/ml?l-抗壞血酸、46μg/ml?l-脯氨酸、10ng/ml轉化生長因子-β1和2.5nmol/l多烯紫杉醇。
3.根據權利要求1所述的一種軟骨誘導培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括dmem/f-12培養(yǎng)基、10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mmol/l丙酮酸鈉、1％胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑、40ng/ml地塞米松、50μg/ml?l-抗壞血酸、46μg/ml?l-脯氨酸、10ng/m...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：宋少帥，方雅，王金武，張婧怡，梁淼洋，方震，孔維澤，馬振江，李子林，戴尅戎，
申請(專利權)人：上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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