【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于細胞生物學檢測，具體涉及一種雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法。
技術介紹
1、血細胞是甲殼動物抵御低氧、低溫、氨氮和重金屬脅迫的重要防御機制，在維持生物正常的生命活動中發揮著重要的作用。自噬是一種真核生物細胞內部的代謝過程，可以通過分解細胞內已受損的大分子物質和細胞器來提供能量和維持細胞內部環境的穩定性。在蟹類中，自噬可能也參與調節氨氮代謝過程。一些研究表明，自噬可以影響蟹類對氨氮的代謝和利用，在環境氨氮濃度較高時，蟹類可能會通過增加自噬活性來應對氨氮的應激。
2、雷帕霉素(rapamycin)是一種免疫抑制劑和抗腫瘤藥物，它也被發現可以通過抑制mtor信號通路調節細胞自噬過程。近年來對于自噬的研究變成熱點問題，雷帕霉素也因此成為焦點。盡管雷帕霉素誘導的血細胞自噬在哺乳動物和其他模式生物中已經得到廣泛研究，但是對于蟹類自噬功能研究相對較少，且主要基于凍存樣本開展工作。基于分離細胞的自噬研究方法在蟹類中一直不成體系，限制了在體功能分析，因此鮮有相關報道。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，從而克服現有技術的不足，通過探究雷帕霉素對蟹類自噬的誘導，為蟹類血細胞功能改善提供實踐依據，并為蝦蟹養殖產業的可持續發展提供理論參考。
2、為了實現上述目的，本專利技術的技術方案為：
3、第一方面，本專利技術提供了一種雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，包括以下步驟：
4、利用雷帕霉素溶液對蟹進行
5、在一些其他實施方式中，利用雷帕霉素溶液對蟹進行處理前，還包括對蟹體進行消毒，所述消毒為用酒精棉球擦拭蟹體最后一對游泳足基部。
6、在一些其他實施方式中，所述雷帕霉素溶液的濃度為1～2mg·ml-1；優選的，所述雷帕霉素溶液的濃度為1.5mg·ml-1；
7、所述雷帕霉素溶液的制備方法為：將雷帕霉素溶解于二甲基亞砜(dmso)中，形成雷帕霉素儲備液，然后，利用生理鹽水稀釋雷帕霉素儲備液即得。
8、所述處理的條件為：溫度為21～26℃，處理時間為6～48h；
9、優選的，所述處理的條件為：溫度為23±1℃，處理時間為24h。
10、在一些其他實施方式中，所述血淋巴的采集方法為：用酒精棉球擦拭蟹體最后一對游泳足基部；從蟹的最后一對游泳足基部取血淋巴；將血淋巴與抗凝劑混勻，經細胞篩過濾后即得蟹類血淋巴；其中，所述血淋巴與抗凝劑的體積比為1：(1-3)；
11、在一些其他實施方式中，還包括，在采集血淋巴之前，還包括對蟹體進行消毒，所述消毒為用酒精棉球擦拭蟹體最后一對游泳足基部。
12、所述抗凝劑的組成為：3～5mg·ml-1、檸檬酸鈉5～10mg·ml-1、葡萄糖15～25mg·ml-1；
13、優選的，所述抗凝劑的組成為：4.2mg·ml-1、檸檬酸鈉8mg·ml-1、葡萄糖20.6mg·ml-1。
14、在一些其他實施方式中，所述血細胞懸液的制備方法為：將所述血淋巴離心、除去上清，得到細胞沉淀；使用pbs緩沖液將細胞沉淀重懸，得到細胞重懸液；將pbs緩沖液與所述細胞重懸液混合；重復離心、去上清、重懸操作步驟1～2次，得到血細胞懸液；優選的，所述血細胞懸液中血細胞的密度≥1×106個/ml。
15、在一些其他實施方式中，所述血細胞檢測液為蟹類血細胞激光共聚焦顯微鏡檢測液和蟹類血細胞流式細胞儀檢測液；
16、所述蟹類血細胞激光共聚焦顯微鏡檢測液的制備方法為：
17、將所述蟹類血細胞懸液和等體積的細胞核熒光探針、等體積的自噬熒光探針混勻，避光孵育30min，4℃、500g離心5min，棄上清，pbs重懸，重復離心1～2次，得到蟹類血細胞激光共聚焦顯微鏡檢測液；
18、所述蟹類血細胞流式細胞儀檢測液的制備方法為：將所述蟹類血細胞懸液分別與等體積的細胞核熒光探針、自噬熒光探針、溶酶體綠色熒光探針、ros熒光探針混勻，避光孵育30min，4℃、500g離心5min，棄上清，pbs重懸，重復離心1～2次，得到蟹類血細胞流式細胞儀檢測液。
19、在一些其他實施方式中，所述細胞核熒光探針為hoechst?33342細胞核熒光探針；
20、所述自噬熒光探針為cyto-id；
21、所述溶酶體綠色熒光探針為lyso-tracker?green；
22、所述ros熒光探針為h2dcfda。
23、在一些其他實施方式中，所述自噬水平檢測為：采用激光共聚焦顯微鏡對所述蟹類血細胞激光共聚焦顯微鏡檢測液進行檢測，通過細胞熒光強度，定性檢測血細胞自噬體結構；
24、采用流式細胞儀所述蟹類血細胞流式細胞儀檢測液進行檢測，檢測血細胞熒光強度，定量檢測血細胞自噬體水平、溶酶體活性及ros相對含量。
25、第二方面，本專利技術提供一種蟹類血細胞檢測液，采用第一方面所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法獲得。
26、第三方面，本專利技術提供第二方面所述蟹類血細胞檢測液在在激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測蟹類血細胞自噬體水平中的應用。
27、本專利技術的有益效果：
28、(1)本專利技術對雷帕霉素在正常和氨氮脅迫下誘導蟹類血細胞自噬體效果進行了研究與分析，通過自噬體結構的定性和定量檢測，并結合溶酶體活性以及活性氧相對含量來確認誘導血細胞自噬的效果。
29、(2)本專利技術基于分子探針的熒光檢測方法具有靈敏度高、操作簡單、無創檢測等優點，且激光共聚焦顯微鏡與流式細胞儀的檢測結果可相互印證。
30、(3)本專利技術通過探究雷帕霉素對蟹類自噬的誘導，可以為蟹類血細胞功能改善提供新的實踐依據，并為蝦蟹養殖產業的可持續發展提供理論參考。
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1.一種雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，所述雷帕霉素溶液的濃度為1-2mg·ml-1；
3.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，所述處理的條件為：溫度為21～26℃，處理時間為6～48h；
4.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，所述血淋巴的采集方法為：從蟹的最后一對游泳足基部取血淋巴；將血淋巴與抗凝劑混勻，經細胞篩過濾后即得蟹類血淋巴；其中，所述血淋巴與抗凝劑的體積比為1：(1-3)；
5.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，所述血細胞懸液的制備方法為：將所述血淋巴離心、除去上清，得到細胞沉淀；使用PBS緩沖液將細胞沉淀重懸，得到細胞重懸液；將PBS緩沖液與所述細胞重懸液混合；重復離心、去上清、重懸操作步驟1～2次，得到血細胞懸液；優選的，所述血細胞懸液中血細胞的密度≥1×106個/mL。
6.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的
7.根據權利要求6所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，
8.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，所述自噬水平檢測為：采用激光共聚焦顯微鏡對所述蟹類血細胞激光共聚焦顯微鏡檢測液進行檢測，通過細胞熒光強度，定性檢測血細胞自噬體結構；
9.一種蟹類血細胞檢測液，其特征在于，采用權利要求1-8任一項所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法獲得。
10.一種權利要求9所述蟹類血細胞檢測液在激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測蟹類血細胞自噬體水平中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，所述雷帕霉素溶液的濃度為1-2mg·ml-1；
3.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，所述處理的條件為：溫度為21～26℃，處理時間為6～48h；
4.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，所述血淋巴的采集方法為：從蟹的最后一對游泳足基部取血淋巴；將血淋巴與抗凝劑混勻，經細胞篩過濾后即得蟹類血淋巴；其中，所述血淋巴與抗凝劑的體積比為1：(1-3)；
5.根據權利要求1所述雷帕霉素誘導蟹類血細胞自噬的方法，其特征在于，所述血細胞懸液的制備方法為：將所述血淋巴離心、除去上清，得到細胞沉淀；使用pbs緩沖液將細胞沉淀重懸，得到細胞重懸液；將pbs緩沖液與所述細胞重懸液混合...
【專利技術屬性】
技術研發人員：路允良，劉盈盈，曹建偉，張月琪，
申請(專利權)人：青島農業大學，
類型：發明
國別省市：
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