【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物科學，具體涉及靶向大鯢虹彩病毒納米抗體制備及其應用。
技術介紹
1、大鯢俗稱娃娃魚，在《世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄》中被列為極危(cr)，同時也是我國的二級重點保護野生動物。大鯢因其肉質細嫩，營養豐富而被喻為“水中活人參”。同時隨著我國大鯢養殖技術的突破，目前大鯢的規模化人工養殖已在全國廣泛推廣。大鯢虹彩病毒是目前唯一發現的大鯢性病毒疾病，該病毒的傳播給大鯢的規模化養殖帶來了大規模殺傷，嚴重挑戰了大鯢養殖的健康發展。大鯢虹彩病毒通過多種途徑傳播：受污染的水體、身體接觸和攝入受感染的組織。大鯢虹彩病毒檢測具有重要意義，主要包括保護瀕危物種、控制疾病傳播、保障養殖業安全、維護生態環境平衡以及推動科學研究。養殖業中，定期的檢測可保障養殖場的健康和收益。
2、目前用于大鯢虹彩病毒檢測的方法包括pcr、細胞培養、感染組織的顯微鏡檢查、免疫學方法。pcr技術具有高度的特異性和靈敏度，能夠快速準確地檢測目標dna序列，但需要專業設備和技術，并且可能存在假陽性結果。培養方法雖然簡單直觀，但需要較長時間且對細胞數量要求高，容易漏檢低濃度樣品。顯微鏡檢查在檢測虹彩病毒時因敏感性和特異性不足、操作復雜、限制了其診斷準確性。
3、免疫學方法具有較高的特異性，但受抗體質量和配對的影響，可能存在交叉反應或低靈敏。與傳統單克隆抗體相比，重組抗體的生產成本更低且具有更好的均一性，納米抗體作為一種前沿的重組抗體具有分子量小、生產成本低、純化簡單等優勢，是目前已知的最小抗原結合單位。而目前還未有抗大鯢虹彩病毒納米抗體
技術實現思路
1、針對上述不足，本專利技術的第一個目的是提供具有表達成本低、難度低、來源穩定，能夠有效地結合大鯢虹彩病毒，能特異性的實現對大鯢虹彩病毒的免疫分析的的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體。
2、本專利技術的第二個目的是提供一種靶向大鯢虹彩病毒納米抗體的制備方法。
3、本專利技術還有一個目的是提供上述靶向大鯢虹彩病毒納米抗體作為大鯢虹彩病毒免疫檢測試劑或檢測試劑盒中的應用。
4、為此，本專利技術提供的第一個技術方案是這樣的：
5、一種靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，所述的納米抗體氨基酸序列如seq?id?no.1-6所示。
6、本專利技術提供的第二個技術方案是上述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體的制備方法，包括有如下的步驟：
7、(1)采用大鯢虹彩滅活病毒對羊駝進行免疫，免疫后收集羊駝外周血淋巴細胞進行mrna提取，以所述的mrna為模板合成cdna第一鏈，以獲得的cdna為模板進行pcr擴增，獲得編碼納米抗體的dna片段；
8、(2)將所述的編碼納米抗體的dna片段與pcomb3xss載體連接，轉化到感受態細胞，構建納米抗體初始文庫，并且進行擴大培養得到納米抗體文庫。
9、(3)將大鯢虹彩病毒作為包被抗原，對所述的納米抗體文庫進行富集淘選篩選得到抗大鯢虹彩病毒的納米抗體噬菌粒；
10、(4)將噬菌粒轉化至宿主表達菌，進行誘導表達出納米抗體，純化得到靶向大鯢虹彩病毒納米抗體序列。
11、進一步的，上述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，步驟(1)所述的mrna提取采用trizol試劑盒提取。
12、進一步的，上述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，步驟(1)所述的pcr擴增時采用的引物序列如下：
13、引物1的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；
14、引物2的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；
15、引物3的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；
16、引物4的核苷酸序列如seq?id?no.10所示；
17、引物5的核苷酸序列如seq?id?no.11所示。
18、進一步的，上述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，步驟(2)所述的擴大培養是將復蘇完成后的菌液加入到培養基中，37℃震蕩后2小時后，加入輔助噬菌體對初始文庫進行擴大，加入輔助噬菌體后震蕩2小時，加入卡那霉素，隨后震蕩過夜，第二天離心收集噬菌體，完成免疫文庫的構建；
19、進一步的，上述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，步驟(3)所述的納米抗體文庫進行富集淘選篩選是通過三輪淘選，挑取單克隆菌落接種到超級肉湯培養基培養，再加入到預包被大鯢虹彩病毒的酶標板上，室溫振蕩洗滌后，加入抗m13-辣根過氧化物酶標抗體，再次室溫振蕩洗滌，加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺進行顯色，挑取吸光度值大于1.5的陽性克隆孔所對應的單克隆菌落進行測序。
20、進一步的，上述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，步驟(4)所述的將噬菌粒轉化至宿主表達菌是使用omega質粒小量提取試劑盒提取陽性單克隆菌落的質粒，隨后將質粒與top10f’感受態細胞混合，冰浴后置于42℃熱水熱擊，隨后再次冰浴，加入超級肉湯培養基，37℃振蕩一小時，完成轉化；將導入完成的top10f’接種到培養液中，振蕩培養到吸光度od6000.8-1.0，加入異丙基硫代半乳糖苷至1mm，誘導過夜。
21、進一步的，上述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，步驟(4)所述的納米抗體的純化向培養過夜的菌液加入beyolytictm細菌活性蛋白抽提試劑裂解細菌，離心收集上清液；將ni-nta基質加入到上述收集的上清液，室溫振蕩后加入到純化柱中；再加入含咪唑的磷酸平衡緩沖液，洗滌純化柱子，洗脫雜蛋白；再加入含咪唑的磷酸洗脫緩沖液，洗脫吸附在鎳柱上的目的蛋白；納米抗體加入透析袋中，在磷酸鹽緩沖液中透析。
22、本專利技術還有一個技術方案是上述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體在作為制備檢測大鯢虹彩病毒的檢測試劑或檢測試劑盒中的應用。
23、本專利技術最后一個技術方案是一種檢測大鯢虹彩病毒相關的檢測試劑，包括第一個技術方案所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體。
24、與現有技術相比，本專利技術提供的技術方案具有如下優點：
25、1、本專利技術提供的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體是基于原核表達方法獲得的，具有表達成本低、難度低、來源穩定等優點；
26、2、本專利技術提供的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體能夠有效地結合大鯢虹彩病毒，能特異性的實現對大鯢虹彩病毒的免疫分析；適用于大鯢虹彩病毒的免疫檢測，將在大鯢虹彩病毒篩查中發揮巨大應用潛力。
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1.一種靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，所述的納米抗體氨基酸序列如SEQID?NO.1-6所示。
2.權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體的制備方法，其特征在于，包括有如下的步驟：
3.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(1)所述的mRNA提取采用TRIzol試劑盒提取。
4.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(1)所述的PCR擴增時采用的引物序列如下：
5.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(3)所述的初始文庫進行擴大培養是將復蘇完成后的菌液加入到培養基中，37℃震蕩后2小時后，加入輔助噬菌體對初始文庫進行擴大，加入輔助噬菌體后震蕩2小時，加入卡那霉素，隨后震蕩過夜，第二天離心收集噬菌體，完成免疫文庫的構建。
6.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(3)所述的納米抗體文庫進行富集淘選篩選是通過三輪淘選，挑取單克隆菌落接種到超級肉湯培養基培養，再加入到預包被大鯢虹彩病毒的酶標板上，室溫振蕩洗滌后，加入
7.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(4)所述的將噬菌粒轉化至宿主表達菌是使用Omega質粒小量提取試劑盒提取陽性單克隆菌落的質粒，隨后將質粒與TOP10F’感受態細胞混合，冰浴后置于42℃熱水熱擊，隨后再次冰浴，加入超級肉湯培養基，37℃振蕩一小時，完成轉化；將導入完成的TOP10F’接種到培養液中，振蕩培養到吸光度OD6000.8-1.0，加入異丙基硫代半乳糖苷至1mM，誘導過夜。
8.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(4)所述的納米抗體的純化向培養過夜的菌液加入BeyoLyticTM細菌活性蛋白抽提試劑裂解細菌，離心收集上清液；將Ni-NTA基質加入到上述收集的上清液，室溫振蕩后加入到純化柱中；再加入含咪唑的磷酸平衡緩沖液，洗滌純化柱子，洗脫雜蛋白；再加入含咪唑的磷酸洗脫緩沖液，洗脫吸附在鎳柱上的目的蛋白；納米抗體加入透析袋中，在磷酸鹽緩沖液中透析。
9.權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體在作為制備檢測大鯢虹彩病毒的檢測試劑或檢測試劑盒中的應用。
10.一種檢測大鯢虹彩病毒相關的檢測試劑，其特征在于，包括權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體。
...【技術特征摘要】
1.一種靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，所述的納米抗體氨基酸序列如seqid?no.1-6所示。
2.權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體的制備方法，其特征在于，包括有如下的步驟：
3.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(1)所述的mrna提取采用trizol試劑盒提取。
4.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(1)所述的pcr擴增時采用的引物序列如下：
5.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(3)所述的初始文庫進行擴大培養是將復蘇完成后的菌液加入到培養基中，37℃震蕩后2小時后，加入輔助噬菌體對初始文庫進行擴大，加入輔助噬菌體后震蕩2小時，加入卡那霉素，隨后震蕩過夜，第二天離心收集噬菌體，完成免疫文庫的構建。
6.根據權利要求1所述的靶向大鯢虹彩病毒納米抗體，其特征在于，步驟(3)所述的納米抗體文庫進行富集淘選篩選是通過三輪淘選，挑取單克隆菌落接種到超級肉湯培養基培養，再加入到預包被大鯢虹彩病毒的酶標板上，室溫振蕩洗滌后，加入抗m13-辣根過氧化物酶標抗體，再次室溫振蕩洗滌，加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺進行顯色，挑取吸光度值大于1.5的陽性...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李冬陽，徐智豪，黎文凱，何綺怡，潘俊康，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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