【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及對聚酯塑料降解效率提高的角質酶突變體及其應用，屬于環境科學領域。
技術介紹
1、聚酯是由多元醇和多元酸縮聚而得的聚合物總稱，生產應用較為廣泛的聚酯材料主要為聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚對苯二甲酸丙二醇酯(ptt)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(pbt)和聚對苯二甲酸-己二酸丁二醇酯(pbat)等工程塑料。然而，這些聚酯塑料經使用丟棄后在環境中自然降解速率極低，其廢棄物長期積累會導致嚴重的環境污染。因此，世界各國均積極探索塑料降解技術。相對于傳統物理化學降解法(酸解、堿解、醇解、熱解等)，生物降解技術是當前研究的熱點。角質酶是屬于α/β-水解酶家族的酯鍵水解酶，其天然底物為植物表層的天然聚酯，近年多項研究已證明角質酶同樣是一種極具潛在價值的人工合成聚酯降解酶。然而，現有角質酶對人工合成聚酯的降解效率仍較低，特別是對苯二甲酸含量較高的結晶型聚酯的降解性能缺陷較大。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是克服角質酶降解pet、ptt、pbt和pbat等人工合成聚酯效率低的不足，提供了新的角質酶的突變體及應用。本專利技術以來源于枝葉堆肥宏基因組來源lcc的突變體iccg為親本酶，通過活性區域正電荷引入和增強氨基酸殘基側鏈結合的策略對該親本酶進行分子設計，以增加酶對底物pbat的活力。
2、本專利技術提供了角質酶iccg對聚酯底物降解效率提高的新型突變體，所述突變體包含對應于seq?id?no:1所示多肽的第48位、第75位、第100位、第247位中的一個或多個氨基酸的
3、在一種實施方式中，第48位的取代是用精氨酸取代絲氨酸。
4、在一種實施方式中，第75位的取代是用精氨酸取代纈氨酸。
5、在一種實施方式中，第100位的取代是用精氨酸取代絲氨酸；
6、在一種實施方式中，第247位的取代是用精氨酸取代絲氨酸。
7、在一種實施方式中，所述的突變體是將seq?id?no:1所示多肽的第48位氨基酸由精氨酸取代絲氨酸，獲得的突變體s48r命名為m8，其氨基酸序列如seq?id?no:3所示。
8、在一種實施方式中，所述的突變體是將seq?id?no:1所示多肽的第75位氨基酸由精氨酸取代纈氨酸，獲得的突變體v75r命名為m9，其氨基酸序列如seq?id?no:4所示。
9、在一種實施方式中，所述的突變體是將seq?id?no:1所示多肽的第100位氨基酸由精氨酸取代絲氨酸，獲得的突變體s100r命名為m10，其氨基酸序列如seq?id?no:5所示。
10、在一種實施方式中，所述的突變體是將seq?id?no:1所示多肽的第247位氨基酸由精氨酸取代絲氨酸，獲得的突變體s247r命名為m11，其氨基酸序列如seq?id?no:6所示。
11、在一種實施方式中，所述的突變體是將seq?id?no:1所示多肽的第48位氨基酸由精氨酸取代絲氨酸，第247位氨基酸由精氨酸取代絲氨酸，獲得的突變體s48r/s247r命名為m12，其氨基酸序列如seq?id?no:7所示。
12、在一種實施方式中，所述的突變體是將seq?id?no:1所示多肽的第100位氨基酸由精氨酸取代絲氨酸，第247位氨基酸由精氨酸取代絲氨酸，同時第218位氨基酸由酪氨酸取代組氨酸，獲得的突變體s100r/s247r命名為m13，其氨基酸序列如seq?id?no:8所示。
13、在一種實施方式中，所述的突變體是將seq?id?no:1所示多肽的第48位氨基酸由精氨酸取代絲氨酸，第75位氨基酸由精氨酸取代纈氨酸，第247位氨基酸由精氨酸取代絲氨酸，獲得的突變體s48r/v75r/s247r命名為m14，其氨基酸序列如seq?id?no:9所示。
14、本專利技術提供了編碼所述突變體的多核苷酸。
15、本專利技術提供了包含所述多核苷酸的核酸構建體或載體。
16、在一種實施方式中，所述載體包括但不限于pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppic3k或ppic9k系列載體。
17、在一種實施方式中，所述載體為pet24a，將編碼所述突變體的多核苷酸插入pet24a載體的多克隆酶切位點處。
18、本專利技術提供了表達所述突變體、或包含所述多核苷酸的宿主細胞。
19、在一種實施方式中，所述宿主細胞包括但不限于大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母。
20、本專利技術提供了生產所述角質酶突變體的方法。
21、在一種實施方式中，所述方法包括：
22、a)在適合于表達所述變體的條件下培養本專利技術的宿主細胞；以及
23、b)任選地回收所述變體。
24、在一種實施方式中，所述a)是將所述宿主細胞在含碳源、氮源和無機鹽的培養基中培養。
25、在一種實施方式中，所述a)是將所述宿主細胞在lb培養基中在35～40℃、150～250rpm條件下培養至od600＝0.8±0.5，后添加終濃度為0.1mm的iptg，在20～30℃、150～250rpm下培養獲得發酵液。
26、在一種實施方式中，所述b)是將發酵液離心并取上清液，得到粗酶液。
27、本專利技術提供了含有所述角質酶突變體的產品。
28、在一種實施方式中，所述產品包括但不限于含有所述角質酶突變體的酶制劑或組合物。
29、在一種實施方式中，所述酶制劑或組合物中含有酶保護劑；所述保護劑包括酸堿調節劑、凍干保護劑。
30、本專利技術提供了一種降解聚己二酸/對苯二甲酸丁二醇酯或含有聚己二酸/對苯二甲酸丁二醇酯的物質的方法，所述方法為向含有聚己二酸/對苯二甲酸丁二醇酯的體系中加入所述角質酶突變體進行反應。
31、在一種實施方式中，所述角質酶突變體的添加量不少于0.6mg/g底物。
32、在一種實施方式中，在ph8.0±0.5、70～75℃、150～250rpm下反應。
33、在一種實施方式中，反應時間不少于24h。
34、在一種實施方式中，反應時間不少于48h。
35、本專利技術提供了所述突變體在降解聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚對苯二甲酸丙二醇酯(ptt)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(pbt)和聚對苯二甲酸-己二酸丁二醇酯(pbat)等聚酯塑料塑料以及含有上述聚酯成分的物質中的應用。
36、在一種實施方式中，所述含有聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚對苯二甲酸丙二醇酯(ptt)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(pbt)和聚對苯二甲酸-己二酸丁二醇酯(pbat)等聚酯的物質包括農用地膜、吸管、塑料袋等物質。
37、有益效果：本專利技術通過對來源于枝葉堆肥宏基因組來源lcc的突變體iccg進行改造得到一系列突變體，所述突變體是在所述iccg的底物結合位點附近發生單點或多點突變，對其第48位、第75位、第100位、第247位發生突本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.角質酶突變體，其特征在于，在SEQ?ID?NO:1所示親本的基礎上，具有第48位、第75位、第100位、第247位中的一個或多個氨基酸的取代。
2.根據權利要求1所述的角質酶突變體，其特征在于，具有(a)～(d)中的一個或多個突變：
3.編碼權利要求1或2所述突變體的多核苷酸。
4.包含權利要求3所述多核苷酸的載體。
5.表達權利要求1或2所述突變體、或包含權利要求3所述多核苷酸的宿主細胞。
6.制備權利要求1或2所述角質酶突變體的方法，其特征在于，所述方法包括：
7.含有權利要求1或2所述角質酶突變體的產品。
8.一種降解聚己二酸/對苯二甲酸丁二醇酯或含有聚己二酸/對苯二甲酸丁二醇酯的物質的方法，其特征在于，向含有聚己二酸/對苯二甲酸丁二醇酯的體系中加入權利要求1或2所述角質酶突變體進行反應。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述角質酶突變體的添加量不少于0.6mg/g底物；所述反應是在70～75℃、150～250rpm下反應。
10.權利要求1或2所述突變
...【技術特征摘要】
1.角質酶突變體，其特征在于，在seq?id?no:1所示親本的基礎上，具有第48位、第75位、第100位、第247位中的一個或多個氨基酸的取代。
2.根據權利要求1所述的角質酶突變體，其特征在于，具有(a)～(d)中的一個或多個突變：
3.編碼權利要求1或2所述突變體的多核苷酸。
4.包含權利要求3所述多核苷酸的載體。
5.表達權利要求1或2所述突變體、或包含權利要求3所述多核苷酸的宿主細胞。
6.制備權利要求1或2所述角質酶突變體的方法，其特征在于，所述方法包括：
7.含有權利要求1或2所述角質...
【專利技術屬性】
技術研發人員：夏偉，吳敬，胡康琦，薛苗苗，顏正飛，陳晟，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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