【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種呼吸道合胞病毒（rsv）感染樹鼩主動脈血管內皮細胞模型及其建立方法，屬于生物。
技術介紹
1、呼吸道合胞病毒（respiratory?syncytial?virus,?rsv），隸屬于副黏病毒科，是一種攜帶單鏈負股rna且具有包膜的重要呼吸道病原體。該病毒在嬰幼兒及老年群體中尤為肆虐，能誘發嚴重的呼吸道感染癥狀，諸如發熱、咳嗽、呼吸窘迫，極端情況下甚至可導致心力衰竭乃至死亡。全球范圍內，每年有數以千萬計的兒童遭受rsv侵襲，其中不少不幸夭折。遺憾的是，盡管形勢嚴峻，當前國際上僅有gsk、輝瑞及moderna三家公司推出的三款rsv疫苗面世，而我國在此領域尚屬空白，既無有效疫苗亦無特效藥物上市，這極大地制約了rsv感染的防治手段。
2、在rsv感染疾病特性探索、藥物及疫苗研發進程中，動物模型扮演著不可或缺的角色。盡管棉鼠作為既往公認的rsv動物模型，在疾病機制解析及藥物疫苗評估中得到了廣泛應用，但其在模擬人類免疫反應及疾病表象上存在局限，加之當前棉鼠資源稀缺，嚴重阻礙了rsv基礎研究與疫苗開發的進程。因此，探尋新的動物模型顯得尤為迫切。
3、此外，rsv病毒的體外培養體系同樣至關重要，它直接關系到rsv感染模型的成功構建與疫苗效能的驗證。當前，rsv病毒培養主要依賴于人喉表皮樣癌細胞（hep-2）、猴腎細胞（vero）等，然而這些細胞存在培養周期長、滴度判定繁瑣且滴度偏低等問題，難以在現有技術框架下實現顯著提升。因此，篩選更為適宜的病毒培養基質細胞成為了一項重要的創新策略。
4
5、為驗證樹鼩在rsv研究中的潛力，我們充分利用豐富的樹鼩細胞資源，開展了rsv病毒對樹鼩多種細胞的培養實驗，結果顯示，永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞對rsv高度敏感，該細胞展現出更為典型的細胞合胞體病變效應、更快的病變進程，并適用于更為簡便易行的tcid50病毒滴度測定方法。
技術實現思路
1、本專利技術提供了一種基于樹鼩永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞的rsv體外感染模型，解決現有rsv病毒培養體系的培養周期長、滴度判定方法復雜和滴度不高等問題，為rsv感染機制的研究提供實驗平臺，也為rsv感染樹鼩體內模型的建立提供合適的病毒和技術支撐；利用這一模型，能夠制備出高感染滴度的rsv病毒，同時建立的特異性的病毒載量檢查方法和便捷的tcid50病毒滴度測定方法，為rsv病毒感染能力的精確評價提供了有力支持。
2、本專利技術通過如下技術方案實現上述目的：
3、1、樹鼩原代主動脈血管內皮細胞的分離培養
4、取1歲左右健康樹鼩，腹腔注射3%戊巴比妥鈉過量麻醉處死，迅速剪開胸腔，暴露心臟部位，使用含1%青霉素-鏈霉素的生理鹽水執行心臟灌注；灌注結束后，從右心耳處向上理出升主動脈，剪取主動脈弓段；轉入4℃預冷含1%青霉素-鏈霉素的生理鹽水中，反復沖洗，剪去分支，剔除血管外殘留結締組織；縱向剪開主動脈弓，將內膜外翻，剪成0.8-1.2mm小塊；用鑷子將組織塊轉移至t25細胞培養瓶，內膜側貼壁，靜置2-5min后倒置培養瓶，加入0.8-1ml?含10%?fbs和1%青霉素-鏈霉素（雙抗）的dmem/f-12培養基，在37℃、5%co2條件下培養20min后，輕輕轉正培養瓶，讓組織塊浸到培養液，但不至于漂??；培養12h后，再補加培養基（含10%?fbs和1%雙抗的dmem/f-12培養基）2-3ml；繼續培養數日，每隔2天更換新鮮培養基，定期觀察細胞生長狀況；待組織塊周邊細胞貼壁面積達60-80%，即可使用0.25%胰酶（含edta）進行首次消化傳代，隨后連續傳代培養3-5次；通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態，通過cd31和vwf的免疫熒光實驗確定血管內皮細胞的特性；
5、2、永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞系的建立
6、將生長狀態良好的原代樹鼩主動脈血管內皮細胞以2×105?cells/ml的密度接種于6孔板，每孔2?ml，放入37℃、5%?co2培養箱中培養；待細胞匯合度達到80%以上時，用pbs清洗2次，加入含4μg/ml助轉劑（polybrene）的培養液(dmem/f12+1%雙抗+2%?fbs)?1?ml，以感染復數(moi)為30接種攜帶sv40t基因的慢病毒，并設未接種慢病毒的細胞對照孔，置于37℃、5%?co2培養箱中培養4h后，補加含4μg/ml助轉劑的培養液(dmem/f12+1%雙抗+2%fbs)?1ml繼續培養；24?h后，更換為不含助轉劑的完全培養液(dmem/f12+1%雙抗+10%?fbs)繼續培養；24h后，將培養液更換為含4μg/ml嘌呤霉素的完全培養液(dmem/f12+1%雙抗+10%fbs)進行持續培養，每2?d更換1次含4μg/ml嘌呤霉素的完全培養液；待對照孔的細胞完全死亡，換回完全培養液，將存活的經sv40t轉染的樹鼩主動脈血管內皮細胞進行連續傳代培養50代以上，且細胞形態和生長活力保持一致，得到永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞。
7、3、rsv感染樹鼩永生化主動脈血管內皮細胞
8、使用完全培養液(dmem/f12+1%雙抗+10%?fbs)，將生長狀態良好的永生化原代樹鼩主動脈血管內皮細胞以2×106?cells/ml的密度接種于t25細胞培養瓶，在37℃、5%co2培養箱培養至細胞匯合80%以上；在生物安全柜中，用pbs清洗細胞2次，按moi=0.1接種hep-2細胞來源的已知滴度rsv病毒，孵育40-60min后，吸棄病毒液至1%?84消毒液中滅活，細胞培養瓶補足4?ml培養液(dmem/f12+1%雙抗+2%fbs)?；在37℃、5%co2培養箱持續培養數日，期間每天觀察細胞病變情況，待80%左右細胞完全病變時終止培養；將細胞培養瓶瓶口密封，置于-20℃冰箱凍存12h以上，于室溫解凍，反復凍融2次；在生物安全柜中收集病毒培養物，1000?rpm離心8?min，細胞碎片在底部沉積，取上清即得病毒收獲液。
9、4、rsv感染樹鼩永生化主動脈血管內皮細胞的免疫熒光觀察
10、選擇生長狀態良好的樹鼩永生化主動脈血管內皮細胞，按照105?cells/孔的量接種在24孔培養板，待細胞基本長滿80%左右：在生物安全柜中，按照步驟（3）的方法進行病毒接種和培養；病毒培養48h后，吸棄培養基，用pbs沖洗1次，加入?4%的多聚甲醛固定20min，pbs漂洗3次，每次2min；加入0.5%?triton?x-100進行細胞穿孔20min，pbs清洗3次，每次2min；使用3%的bsa封閉30min，?pbs漂洗3次本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種RSV感染永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞的模型，其特征在于：從樹鼩的主動脈中分離培養原代主動脈血管內皮細胞，并進一步建立永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞系，以該永生化細胞系作為病毒培養基質，通過呼吸道合胞病毒RSV感染實驗，成功構建了RSV感染永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞的模型，并實現高感染滴度RSV病毒的制備。
2.根據權利要求1所述的RSV感染永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞模型，其特征在于：該模型中的永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞對呼吸道合胞病毒展現出高敏感性，在感染RSV后，這些細胞會呈現出典型的細胞合胞體病變效應，且病變進程更迅速。
【技術特征摘要】
1.一種rsv感染永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞的模型，其特征在于：從樹鼩的主動脈中分離培養原代主動脈血管內皮細胞，并進一步建立永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞系，以該永生化細胞系作為病毒培養基質，通過呼吸道合胞病毒rsv感染實驗，成功構建了rsv感染永生化樹鼩主動脈血管內皮細胞的模...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王文廣，陸彩霞，李娜，洪超，李倩倩，丁晨，王璽，仝品芬，杞夢迪，劉欣，陸美麗，
申請(專利權)人：中國醫學科學院醫學生物學研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。