【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
技術介紹
1、三維(3d)細胞培養是一種有前景的技術，以應用于開發和鑒定治療性治療。相對于二維細胞培養系統，三維細胞培養的益處可以在于更接近地模擬生物功能。高質量的細胞樣品制備對于各種臨床和研究應用非常重要。3-d細胞培養可以接近地代表體內特性。需要能夠以適當的成本有效且可重復地培養細胞的高通量3d細胞培養方法和系統。
技術實現思路
1、本文公開了一種用于在孔中產生三維水凝膠系統的方法，所述方法包括：(a)將包括第一丙烯酸酯和第一硫醇化聚合物的第一混合物遞送到孔中，由此在所述孔內形成凹形彎月面；(b)使所述第一混合物的所述第一丙烯酸酯和所述第一硫醇化聚合物交聯以形成第一固化的水凝膠層，其中所述第一固化的水凝膠層包括凹形上表面；(c)將包括第二丙烯酸酯和第二硫醇化聚合物的第二混合物遞送到所述第一固化的水凝膠層的頂部上的所述孔中；(d)使所述第二混合物的所述第二丙烯酸酯和所述第二硫醇化聚合物交聯以在所述第一固化的水凝膠層的頂部上形成第二固化的水凝膠層，其中所述第二固化的水凝膠層包括比所述第一固化的水凝膠層的所述凹形上表面凹度更小的上表面。所述第二固化的層的所述上表面可以是基本上平面的。
2、使所述第一丙烯酸酯和所述第一硫醇化聚合物交聯以形成所述第一固化的水凝膠層可以包括在將所述第一混合物安置于(定位于)所述孔內的同時并在將所述第二混合物已遞送到所述孔中之前，將所述第一混合物暴露于紫外光。使所述第二丙烯酸酯和所述第二硫醇化聚合物交聯以形成所述第二固化的水凝膠層可以包括在將所
3、第二混合物可以進一步包括多個細胞。所述多個細胞可以為未聚集的細胞。所述多個細胞可以在(c)之前已被染色。已被染色的所述多個細胞可以用以下中的一種或多種染色：(i)對細胞核具有特異性的染料，(ii)對細胞膜具有特異性的染料，(iii)對活細胞具有特異性的染料，以及(iv)對死細胞具有特異性的染料。所述多個細胞可以用以下中的一種或多種染色：親脂性羰花青染料、雙苯并酰亞胺、氧雜蒽染料或碘化丙啶。在將所述第二混合物遞送到所述孔中之前，所述多個細胞可以用熒光標簽標記。
4、所述第二混合物可以任選地或進一步包括層粘連蛋白，使得層粘連蛋白在第二固化的水凝膠內非共價地分布。在一些實施例中，所述第二混合物中不包含層粘連蛋白。所述第一混合物可以進一步包括光引發劑。所述光引發劑可以包括2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮。所述第二混合物可以進一步包括光引發劑。所述光引發劑可以包括2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
5、所述方法可以進一步包括將細胞培養基添加到所述三維水凝膠系統中。所述細胞培養基可以包括以下中的一種或多種：磷酸鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、硝酸鐵、氯化鈣或氯化鉀。所述第一混合物在被遞送到所述孔中時的運動粘度可以介于0.5平方毫米/秒與10平方毫米/秒之間。所述第二混合物在被遞送到所述孔中時的運動粘度可以介于0.5平方毫米/秒與10平方毫米/秒之間。
6、所述第一丙烯酸酯和所述第二丙烯酸酯中的一者或兩者可以為多臂peg丙烯酸酯。所述第一丙烯酸酯和所述第二丙烯酸酯中的一者或兩者可以為peg二丙烯酸酯。所述第一混合物的所述peg二丙烯酸酯的數均分子量可以大于三千道爾頓。在一些實施例中，所述第一混合物的所述peg二丙烯酸酯的數均分子量可以介于三千道爾頓與四千道爾頓之間。在一些實施例中，所述第一混合物的所述peg二丙烯酸酯的數均分子量可以介于約7千道爾頓與15千道爾頓之間。所述第二混合物的所述peg二丙烯酸酯的數均分子量可以大于三千道爾頓。在一些實施例中，所述第二混合物的所述peg二丙烯酸酯的數均分子量可以介于三千道爾頓與四千道爾頓之間。在一些實施例中，所述第二混合物的所述peg二丙烯酸酯的數均分子量可以介于7千道爾頓與15千道爾頓之間。
7、所述第一硫醇化聚合物和所述第二硫醇化聚合物中的一者或兩者可以為硫醇化明膠。所述硫醇化明膠的硫醇化程度可以介于20％與30％之間。在一些實施例中，所述第二混合物中的peg二丙烯酸酯與硫醇化明膠的重量比介于1:4與2:1之間，如1:2。在一些實施例中，所述第二混合物中的peg二丙烯酸酯與硫醇化明膠的重量比介于1:1與8:1之間(例如，介于2:1與8:1之間)。所述第二混合物可以包括2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮，2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮與硫醇化明膠的重量比介于1:20與1:100之間，如1:50。
8、所述第二混合物可以包括層粘連蛋白，硫醇化明膠與層粘連蛋白的重量比介于1:1與8:1之間，如4:1。所述第二混合物中的層粘連蛋白的濃度可以為至少0.1mg/ml。所述第二混合物中的層粘連蛋白的濃度可以不大于1.0mg/ml。所述第二混合物中的層粘連蛋白的濃度可以介于0.2mg/ml與1.0mg/ml之間或介于0.2mg/ml與0.6mg/ml之間。
9、所述孔可以是多孔板的孔陣列中的一個孔。所述孔陣列可以包括至少96個孔。所述孔陣列可以包括至少384個孔。所述孔陣列可以包括至少1536個孔。所述第一混合物和所述第二混合物的所述遞送可以在小于一個小時內在384個孔上完成。所述第一混合物的所述遞送可以在小于20分鐘內在384個孔上完成。所述第二混合物的所述遞送可以在小于20分鐘內在384個孔上完成。所述第一混合物和所述第二混合物的所述遞送可以在小于一個小時內在1536個孔上完成。所述第一混合物的所述遞送可以在小于30分鐘內在1536個孔上完成。所述第二混合物的所述遞送可以在小于30分鐘內在1536個孔上完成。
10、所述第一混合物的遞送可以包括通過機器人系統遞送。所述第二混合物的遞送可以包括通過機器人系統遞送。遞送所述第一混合物可以包括將第一量的所述第一混合物分配到所述孔中，以及從所述孔中抽吸第二量的所述第一混合物。所述第一量可以大于所述第二量。遞送所述第二混合物可以包括將第一量的所述第二混合物分配到所述孔中，以及從所述孔中抽吸第二量的所述第二混合物。所述第一量可以大于所述第二量。
11、所述第二混合物可以包括細胞。所述細胞在整個所述第二固化的水凝膠層中可以基本上均勻地分布。本文公開了一種通過根據本文所描述的方法形成的水凝膠。
12、通過引用并入
13、本說明書中所提到的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于在孔中產生三維水凝膠系統的方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述第二固化的層的所述上表面是基本上平面的。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中使所述第一丙烯酸酯和所述第一硫醇化聚合物交聯以形成所述第一固化的水凝膠層包括在將所述第一混合物安置于所述孔內的同時并在將所述第二混合物已遞送到所述孔中之前，將所述第一混合物暴露于紫外光。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中使所述第二丙烯酸酯和所述第二硫醇化聚合物交聯以形成所述第二固化的水凝膠層包括在將所述第一固化的水凝膠層和所述第二混合物兩者都安置于所述孔內的同時，將所述第二混合物暴露于紫外光。
5.根據權利要求4所述的方法，其中將所述第一混合物暴露于紫外光的時間段長于將所述第二混合物暴露于紫外光的時間段。
6.根據權利要求5所述的方法，其中將所述第二混合物暴露于紫外光小于12秒，并且將所述第一混合物暴露于紫外光大于12秒。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中將所述第一混合物和所述第二混合物暴露于紫外光10
8.根據權利要求4至7中任一項所述的方法，其中所述紫外光的平均波長為320nm和390nm。
9.根據權利要求4至8中任一項所述的方法，其中所述紫外光的強度介于200mW/cm2與300mW/cm2之間。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第二混合物進一步包括多個細胞。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多個細胞為未聚集的細胞。
12.根據權利要求10至11中任一項所述的方法，其中所述多個細胞在(c)之前已被染色。
13.根據權利要求12所述的方法，其中已被染色的所述多個細胞已用以下中的一種或多種染色：(i)對細胞核具有特異性的染料，(ii)對細胞膜具有特異性的染料，(iii)對活細胞具有特異性的染料，以及(iv)對死細胞具有特異性的染料。
14.根據權利要求13所述的方法，其中已被染色的所述多個細胞已用以下中的一種或多種染色：親脂性羰花青染料、雙苯并酰亞胺、氧雜蒽染料或碘化丙啶。
15.根據權利要求10或權利要求11所述的方法，其中所述多個細胞在(c)之前已用熒光標簽標記。
16.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第二混合物不包含層粘連蛋白。
17.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述第二混合物進一步包括層粘連蛋白，使得層粘連蛋白非共價地分布在第二固化的水凝膠內。
18.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一混合物進一步包括光引發劑。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述光引發劑包括2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
20.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第二混合物進一步包括光引發劑。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述光引發劑包括2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
22.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其進一步包括將細胞培養基添加到所述三維水凝膠系統中。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述細胞培養基包括以下中的一種或多種：磷酸鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、硝酸鐵、氯化鈣或氯化鉀。
24.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一混合物在被遞送到所述孔中時的運動粘度介于0.5平方毫米/秒與10平方毫米/秒之間。
25.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第二混合物在被遞送到所述孔中時的運動粘度介于0.5平方毫米/秒與10平方毫米/秒之間。
26.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一丙烯酸酯和所述第二丙烯酸酯中的一者或兩者為多臂PEG丙烯酸酯。
27.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一丙烯酸酯和所述第二丙烯酸酯中的一者或兩者為PEG二丙烯酸酯。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述第一混合物的所述PEG二丙烯酸酯的數均分子量大于三千道爾頓。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述第一混合物的所述PEG二丙烯酸酯的數均分子量介于三千道爾頓與四千道爾頓之間。
30.根據權利要求27所述的方法，其中所述第二混合物的所述PEG二丙烯酸酯的數均分子量大于三千道爾頓。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述第二混合物的所述PEG二丙烯酸酯的數均分子量介于三千道爾頓與四千道爾頓之間。...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種用于在孔中產生三維水凝膠系統的方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述第二固化的層的所述上表面是基本上平面的。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中使所述第一丙烯酸酯和所述第一硫醇化聚合物交聯以形成所述第一固化的水凝膠層包括在將所述第一混合物安置于所述孔內的同時并在將所述第二混合物已遞送到所述孔中之前，將所述第一混合物暴露于紫外光。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中使所述第二丙烯酸酯和所述第二硫醇化聚合物交聯以形成所述第二固化的水凝膠層包括在將所述第一固化的水凝膠層和所述第二混合物兩者都安置于所述孔內的同時，將所述第二混合物暴露于紫外光。
5.根據權利要求4所述的方法，其中將所述第一混合物暴露于紫外光的時間段長于將所述第二混合物暴露于紫外光的時間段。
6.根據權利要求5所述的方法，其中將所述第二混合物暴露于紫外光小于12秒，并且將所述第一混合物暴露于紫外光大于12秒。
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中將所述第一混合物和所述第二混合物暴露于紫外光10秒至20秒。
8.根據權利要求4至7中任一項所述的方法，其中所述紫外光的平均波長為320nm和390nm。
9.根據權利要求4至8中任一項所述的方法，其中所述紫外光的強度介于200mw/cm2與300mw/cm2之間。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第二混合物進一步包括多個細胞。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述多個細胞為未聚集的細胞。
12.根據權利要求10至11中任一項所述的方法，其中所述多個細胞在(c)之前已被染色。
13.根據權利要求12所述的方法，其中已被染色的所述多個細胞已用以下中的一種或多種染色：(i)對細胞核具有特異性的染料，(ii)對細胞膜具有特異性的染料，(iii)對活細胞具有特異性的染料，以及(iv)對死細胞具有特異性的染料。
14.根據權利要求13所述的方法，其中已被染色的所述多個細胞已用以下中的一種或多種染色：親脂性羰花青染料、雙苯并酰亞胺、氧雜蒽染料或碘化丙啶。
15.根據權利要求10或權利要求11所述的方法，其中所述多個細胞在(c)之前已用熒光標簽標記。
16.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第二混合物不包含層粘連蛋白。
17.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述第二混合物進一步包括層粘連蛋白，使得層粘連蛋白非共價地分布在第二固化的水凝膠內。
18.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一混合物進一步包括光引發劑。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述光引發劑包括2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
20.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第二混合物進一步包括光引發劑。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述光引發劑包括2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
22.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其進一步包括將細胞培養基添加到所述三維水凝膠系統中。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述細胞培養基包括以下中的一種或多種：磷酸鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、硝酸鐵、氯化鈣或氯化鉀。
24.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一混合物在被遞送到所述孔中時的運動粘度介于0.5平方毫米/秒與10平方毫米/秒之間。
25.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第二混合物在被遞送到所述孔中時的運動粘度介于0.5平方毫米/秒與10平方毫米/秒之間。
26.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一丙烯酸酯和所述第二丙烯酸酯中的一者或兩者為多臂peg丙烯酸酯。
27.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述第一丙烯酸酯和所述第二丙烯酸酯中的一者或兩者為peg二丙烯酸酯。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述第一混合物的所述peg二丙烯酸酯的數均分子量大于三千道爾頓。<...
【專利技術屬性】
技術研發人員：A·馬佐奇，R·尼利，KR·斯凱利，E·米切爾，
申請(專利權)人：知名醫藥公司，
類型：發明
國別省市：
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