【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及醫(yī)學(xué)生物材料，特別地涉及脫細胞基質(zhì)(ecm)，尤其地源自水生動物的脫細胞基質(zhì)(ecm)，其中該脫細胞基質(zhì)(ecm)可在體外中性水溶液中凝膠化。
技術(shù)介紹
1、脫細胞基質(zhì)(ecm)是指從人或動物組織中除去具有免疫原性的細胞成分，以形成僅保留ecm的動物組織衍生的支架。ecm在植入體內(nèi)后，能夠隨時間的延長逐漸被患者自身的組織所取代，引導(dǎo)機體組織再生。在調(diào)節(jié)生物物理刺激，生物化學(xué)和分子信號以及空間結(jié)構(gòu)方面天然ecm發(fā)揮著重要作用。ecm作為一種天然可降解生物支架材料，其維持了天然的生物學(xué)結(jié)構(gòu)，并使大部分生物學(xué)功能得以保留。ecm還具有合適的孔隙度和吸附性，適合細胞的黏附和生長，生物相容性良好，因此也具備優(yōu)秀的功能重建作用，易于實現(xiàn)組織再生及組織生物學(xué)功能再造。國內(nèi)外均有大量的ecm研究報導(dǎo)，其成果也已轉(zhuǎn)化成各種醫(yī)療器械產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用。
2、據(jù)現(xiàn)有資料報導(dǎo)，目前ecm根據(jù)其外觀形式主要可分為固體狀及凝膠狀。固體狀常被制成片狀、顆粒狀、柱狀、粉劑等形式。
3、目前市場上常見的脫細胞真皮基質(zhì)一般來源于豬、牛、羊和馬，它們的制作工藝和臨床應(yīng)用已趨于完善。然而，由于近年來牛海綿狀腦病(bse)和高致病性禽流感(hpai)等人畜共患病頻發(fā)，導(dǎo)致豬、牛等哺乳動物的脫細胞基質(zhì)材料頗受爭議。
4、人類同種異體脫細胞基質(zhì)也是一種良好的原位組織修復(fù)材料，在臨床研究中顯示出了優(yōu)秀的促修復(fù)特性。然而直至目前，人類來源的所有器官組織仍然面臨嚴峻的供給缺乏。因此，這類同種來源生物材料的應(yīng)用仍將受到供體不足問題的巨大
5、水生動物源脫細胞基質(zhì)由于具有抗原性低、生物安全性高以及品類和產(chǎn)量豐富的特點，近年已成為國內(nèi)外研究的熱點之一。水生動物源脫細胞基質(zhì)具有與豬、牛等哺乳動物類似的仿生結(jié)構(gòu)，含有更為豐富脂肪和ω-3不飽和脂肪酸，可有效降低炎癥反應(yīng)、促進創(chuàng)面區(qū)域新生血管的生成，在如難愈性創(chuàng)面修復(fù)等領(lǐng)域具有明顯促進作用。
6、脫細胞基質(zhì)由動物源組織經(jīng)脫細胞工藝制備而成，根據(jù)基質(zhì)內(nèi)細胞的數(shù)量和分布情況，脫細胞工藝或多或少都會對基質(zhì)結(jié)構(gòu)造成一定影響。水生動物源脫細胞基質(zhì)中脯氨酸、羥脯氨酸等亞氨基酸含量較低，材料穩(wěn)定性相較陸生動物源脫細胞基質(zhì)弱，在不適宜的過度工藝條件下易造成脫細胞基質(zhì)仿生結(jié)構(gòu)喪失。
7、專利cn113769168a公開了一種用于軟組織填充修復(fù)的脫細胞基質(zhì)微粒產(chǎn)品及其制備方法，制成的脫細胞基質(zhì)為顆粒狀。固體狀脫細胞基質(zhì)具有微觀多孔結(jié)構(gòu)，植入后能為細胞的遷移、增殖和分化提供良好的環(huán)境；但若固體狀結(jié)構(gòu)沒有及時降解并在機體造成了占位效應(yīng)，也將影響組織的愈合和再生。
8、本領(lǐng)域已知，ecm凝膠狀形式通常具有更大的接觸比表面積和更易于控制的降解速率，具有良好應(yīng)用前景。但是，由于ecm結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)已知，凝膠狀形式通常需要將動物外基質(zhì)組織先制成ecm固體狀，再通過酶環(huán)境消化溶解，調(diào)節(jié)ph至中性后制得，這使得制得的凝膠通常無法去除酶殘留，具有一定生物安全風(fēng)險。
9、專利cn105169483a公開了一種脫細胞基質(zhì)凝膠的制備方法及其脫細胞基質(zhì)凝膠，專利技術(shù)人通過先制備固體脫細胞基質(zhì)再粉碎、酶消化、調(diào)節(jié)ph至中性后得到脫細胞基質(zhì)凝膠。這種方法制得的水凝膠通常無法去除酶殘留，具有一定生物安全風(fēng)險；即便引入升溫、透析/超濾等物理方式去除了殘留的酶，也可能導(dǎo)致脫細胞基質(zhì)原有活性因子(如糖胺聚糖、生長因子等)損失，降低了材料的有效性。因此，要制備高生物安全性和高生物活性的脫細胞基質(zhì)凝膠，在保留脫細胞基質(zhì)基本組成和結(jié)構(gòu)的前提下可在體外非酶消化環(huán)境形成脫細胞基質(zhì)凝膠顯得尤為重要。
10、專利cn116617462a公開了一種中性環(huán)境水溶性脫細胞真皮基質(zhì)材料、其制備方法及其應(yīng)用，專利技術(shù)人將細胞真皮基質(zhì)(adm)在鹽酸和酶的環(huán)境中消化溶解，加鹽并調(diào)至中性后透析凍干制成水溶性脫細胞真皮基質(zhì)材料。該專利制得的中性水溶性adm為經(jīng)過酶環(huán)境消化，透析后損失adm原有活性物，所制成品實則為纖維型蛋白固形物。
11、專利cn116747353a公開了一種基于沃頓膠脫細胞基質(zhì)的光交聯(lián)水凝膠制備及其應(yīng)用，專利技術(shù)人將脫細胞后的臍帶組織用酶法消化制得水溶性脫細胞基質(zhì)。該專利所得水溶性脫細胞基質(zhì)利用了酶消化方式，存在酶殘留生物安全風(fēng)險。
12、現(xiàn)有技術(shù)所制ecm或為固體狀、或為凝膠狀，固體狀存在降解可控性差等缺點，凝膠狀存在活性因子損失或酶殘留生物風(fēng)險等問題，在應(yīng)用領(lǐng)域受到一定限制。尤其在處理步驟中，如脫細胞處理步驟中或在脫細胞處理步驟后，使用酶消化方式，則存在酶殘留生物風(fēng)險等問題。現(xiàn)有技術(shù)中的脫細胞基質(zhì)在水中固體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，僅能形成懸濁液，無法提供粘彈性或凝膠支架，在部分應(yīng)用場景，如殘腔填充，會因沉降作用導(dǎo)致材料分布不均。
13、現(xiàn)階段，在本領(lǐng)域中，需要一種脫細胞基質(zhì)材料，具有仿生結(jié)構(gòu)的固體狀，植入機體時，可在一定時間發(fā)揮固體支架作用，誘導(dǎo)細胞遷移至三維微孔結(jié)構(gòu)中，隨后迅速凝膠化，繼續(xù)提供支架作用并逐步釋放活性因子，誘導(dǎo)機體組織修復(fù)、再生；如果需要，并快速降解。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)旨在提供一種可快速凝膠化的脫細胞基質(zhì)及其應(yīng)用。包含本專利技術(shù)脫細胞基質(zhì)的材料為具有仿生結(jié)構(gòu)的固體狀，植入機體時，可在一定時間發(fā)揮固體支架作用，誘導(dǎo)細胞遷移至三維微孔結(jié)構(gòu)中，隨后材料迅速凝膠化，繼續(xù)提供支架作用并逐步釋放活性因子，誘導(dǎo)機體組織修復(fù)、再生；并快速降解。
2、而且，本專利技術(shù)脫細胞基質(zhì)也可在體外中性水溶液中快速凝膠化，制成脫細胞基質(zhì)水凝膠，直接以注射形式應(yīng)用于機體組織，此外，本專利技術(shù)脫細胞基質(zhì)在溶解于水中后可形成脫細胞基質(zhì)的均勻溶液。本專利技術(shù)所述的一種可快速凝膠化且在溶解于水中后可形成均勻溶液的脫細胞基質(zhì)，在誘導(dǎo)硬組織和軟組織修復(fù)、殘腔填充、醫(yī)療美容等領(lǐng)域可形成廣泛應(yīng)用。
3、申請人發(fā)現(xiàn)，本專利技術(shù)所述可快速凝膠化的脫細胞基質(zhì)可以實現(xiàn)上述需求，本專利技術(shù)可快速凝膠化的脫細胞基質(zhì)可以以微粒狀懸浮于鹽溶液(如生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液等)或多糖溶液(如透明質(zhì)酸鈉、殼聚糖、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基甲殼素、硫酸軟骨素等)中，制成植入劑應(yīng)用于醫(yī)療美容、殘腔填充、軟/硬組織缺損等領(lǐng)域的注射，脫細胞基質(zhì)的快速凝膠化特性可為植入劑提供粘彈性支撐，還可通過釋放生長因子等活性成分誘導(dǎo)修復(fù)。也可直接將材料在無菌的體外環(huán)境制成凝膠后灌裝制成植入劑，同樣也可用于醫(yī)療美容、殘腔填充、軟/硬組織缺損等領(lǐng)域，可避免了過濾除菌造成的溶質(zhì)損失。因此，本專利技術(shù)所述可快速凝膠化的脫細胞基質(zhì)兼具固體支架和凝膠的優(yōu)勢，極大豐富脫細胞基質(zhì)材料的應(yīng)用范圍。
4、根據(jù)本專利技術(shù)的一個具體實施方案，本專利技術(shù)脫細胞基質(zhì)，來源于動物的結(jié)締組織、眼組織、臟器組織，具體包含但不限于動物的皮膚組織、骨組織、角膜組織、臟器組織、粘膜組織或結(jié)締組織等。
5、根據(jù)本專利技術(shù)的一個具體實施方案，本專利技術(shù)脫細胞基質(zhì)來源于水生動物，如水生本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.脫細胞基質(zhì)，其特征在于：羥脯氨酸含量為3wt％至11wt％，特別地5wt％至10.8wt％，甚至7.5wt％-10.5wt％，其中脫細胞基質(zhì)與脫細胞前動物組織之間的羥脯氨酸變化率為小于8％，特別地0.1-7％，尤其1-6％，甚至1.5-5％。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求1所述脫細胞基質(zhì)，其中脫細胞基質(zhì)來源于水生動物，如水生動物的皮膚組織、軟骨組織、角膜組織、臟器組織、粘膜組織或結(jié)締組織，優(yōu)選選自水生動物的皮膚組織。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求1或2所述脫細胞基質(zhì)，其中脫細胞基質(zhì)來源于寒帶的水生動物、溫帶的水生動物、亞熱帶的水生動物、或熱帶的水生動物，優(yōu)選該水生生物生活溫度為18-30℃，特別地脫細胞基質(zhì)來源于溫帶的水生動物、亞熱帶的水生動物、或熱帶的水生動物，更優(yōu)選地，所述水生動物選自魚類，更優(yōu)選溫帶、亞熱帶、或熱帶的魚類。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求1-3任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中所述脫細胞基質(zhì)的吸水率為自身重量的2-8倍，特別地吸水率為自身重量的3-7倍，甚至吸水率為自身重量的4-6倍。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求1-4任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中所
6.根據(jù)前述權(quán)利要求1-5任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中所述脫細胞基質(zhì)中IV型膠原蛋白含量小于0.5wt％，特別地小于0.2wt％，尤其地小于0.1wt％；特別地脫細胞基質(zhì)不含IV型膠原蛋白。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求1-6任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中脫細胞基質(zhì)具有下述特征至少之一：
8.根據(jù)前述權(quán)利要求1-7任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中所述脫細胞基質(zhì)具有選自如下的外觀：單層或多層的片狀、管狀、網(wǎng)狀、顆粒狀或微球狀；或結(jié)合輔助器械制成不規(guī)則狀。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求1-8任一項所述脫細胞基質(zhì)的制備方法，其中，所述脫細胞基質(zhì)由動物的組織經(jīng)預(yù)處理和脫細胞處理后制得，其中包括如下步驟：
10.根據(jù)前述權(quán)利要求9所述方法，其中，所述預(yù)處理步驟包括：使用生物酶在0-15℃溫度條件下酶解12-60h，優(yōu)選酶解12-18h或甚至18-21h或尤其地24-48h，任選地，隨后去除肌肉組織、基底膜和/或表皮層，得到無雜組織的組織物質(zhì)，例如得到無雜組織的真皮組織。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求10所述方法，其中，預(yù)處理步驟中，所述生物酶選自彈性蛋白酶、IV型膠原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酪氨酸酶、中性蛋白酶中的至少一種。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求9-11任一項所述方法，其中，預(yù)處理步驟中，所述酶解體系為0.004-0.006wt％的彈性蛋白酶磷酸鹽或彈性蛋白酶三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液；酶解時間為12-18h，甚至14-17h；或者，所述酶解體系為0.003-0.005wt％的胰蛋白酶硼酸鹽或胰蛋白酶磷酸鹽溶液；酶解時間為15-21h，甚至15-19h。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求9-12任一項所述方法，其中，所述脫細胞處理步驟選用化學(xué)方法；在所述化學(xué)方法中，所用試劑不包含致蛋白變性成分，尤其所述致蛋白變性成分為濃鹽酸、尿素、鹽酸胍、十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、二甲基亞砜；或所述脫細胞處理選用物理方法，在所述的物理方法中，特別地使用選自下述的方法：不包含致蛋白變性的高壓處理、激光處理、高速勻化剪切和紫外照射。
14.脫細胞基質(zhì)凝膠，其由根據(jù)前述權(quán)利要求1-8任一項所述脫細胞基質(zhì)、或根據(jù)權(quán)利要求9-13任一項所述的脫細胞基質(zhì)的制備方法獲得的脫細胞基質(zhì)在體外中性水溶液中凝膠化制備。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求14所述脫細胞基質(zhì)凝膠，其中所述脫細胞基質(zhì)的凝膠化濃度小于30g/mL。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求14或15所述脫細胞基質(zhì)凝膠的制備方法，其包括下述步驟：
17.根據(jù)前述權(quán)利要求16所述脫細胞基質(zhì)凝膠的制備方法，其中水溶液選自純水、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、生理鹽水中的一種或幾種，其中水溶液特別地是中性的水溶液。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求16-17任一項所述脫細胞基質(zhì)凝膠的制備方法，其中所述脫細胞基質(zhì)凝膠化溫度為20-40℃，優(yōu)選25-38℃。
19.植入劑，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求1-8任一項所述脫細胞基質(zhì)、或根據(jù)權(quán)利要求9-13任一項所述的脫細胞基質(zhì)的制備方法獲得的脫細胞基質(zhì)，其中脫細胞基質(zhì)呈微粒狀懸浮液形式存在于鹽溶液或多糖溶液中，其中所述鹽溶液如生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液，其中多糖溶液如透明質(zhì)酸鈉、殼聚糖、海藻酸鈉、...
【技術(shù)特征摘要】
1.脫細胞基質(zhì)，其特征在于：羥脯氨酸含量為3wt％至11wt％，特別地5wt％至10.8wt％，甚至7.5wt％-10.5wt％，其中脫細胞基質(zhì)與脫細胞前動物組織之間的羥脯氨酸變化率為小于8％，特別地0.1-7％，尤其1-6％，甚至1.5-5％。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求1所述脫細胞基質(zhì)，其中脫細胞基質(zhì)來源于水生動物，如水生動物的皮膚組織、軟骨組織、角膜組織、臟器組織、粘膜組織或結(jié)締組織，優(yōu)選選自水生動物的皮膚組織。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求1或2所述脫細胞基質(zhì)，其中脫細胞基質(zhì)來源于寒帶的水生動物、溫帶的水生動物、亞熱帶的水生動物、或熱帶的水生動物，優(yōu)選該水生生物生活溫度為18-30℃，特別地脫細胞基質(zhì)來源于溫帶的水生動物、亞熱帶的水生動物、或熱帶的水生動物，更優(yōu)選地，所述水生動物選自魚類，更優(yōu)選溫帶、亞熱帶、或熱帶的魚類。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求1-3任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中所述脫細胞基質(zhì)的吸水率為自身重量的2-8倍，特別地吸水率為自身重量的3-7倍，甚至吸水率為自身重量的4-6倍。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求1-4任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中所述脫細胞基質(zhì)的dna含量小于50ng/mg，特別地小于30ng/mg，尤其地小于20ng/mg。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求1-5任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中所述脫細胞基質(zhì)中iv型膠原蛋白含量小于0.5wt％，特別地小于0.2wt％，尤其地小于0.1wt％；特別地脫細胞基質(zhì)不含iv型膠原蛋白。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求1-6任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中脫細胞基質(zhì)具有下述特征至少之一：
8.根據(jù)前述權(quán)利要求1-7任一項所述脫細胞基質(zhì)，其中所述脫細胞基質(zhì)具有選自如下的外觀：單層或多層的片狀、管狀、網(wǎng)狀、顆粒狀或微球狀；或結(jié)合輔助器械制成不規(guī)則狀。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求1-8任一項所述脫細胞基質(zhì)的制備方法，其中，所述脫細胞基質(zhì)由動物的組織經(jīng)預(yù)處理和脫細胞處理后制得，其中包括如下步驟：
10.根據(jù)前述權(quán)利要求9所述方法，其中，所述預(yù)處理步驟包括：使用生物酶在0-15℃溫度條件下酶解12-60h，優(yōu)選酶解12-18h或甚至18-21h或尤其地24-48h，任選地，隨后去除肌肉組織、基底膜和/或表皮層，得到無雜組織的組織物質(zhì)，例如得到無雜組織的真皮組織。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求10所述方法，其中，預(yù)處理步驟中，所述生物酶選自彈性蛋白酶、iv型膠原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酪氨酸酶、中性蛋白酶中的至少一種。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求9-11任一項所述方法，其中，預(yù)處理步驟中，所述酶解...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：傅維擎，馮嬌燕，黃兆輝，
申請(專利權(quán))人：煙臺德勝海洋生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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