【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物，尤其涉及一種以t-dna作為分子標記鑒定山茶屬茶組植物的方法。
技術介紹
1、山茶屬(camellia)屬于雙子葉綱山茶目山茶科，為多年生常綠灌木或喬木，是山茶科中最大的屬，也是其模式屬。山茶屬植物具有重要的文化和經濟價值，例如以花朵美麗的觀賞種(camelliajaponica.,et?al)以及產茶葉的茶樹(camellia?sinensis.,et?al)著稱。近些年山茶屬的物種數量從120種增長到了280種，但是山茶屬植物的分類問題上存在較大爭議。
2、山茶屬植物作為具有多個重要經濟文化價值作物共同類群，對其分類和系統關系的研究有著重要的戰略意義。過去主流的分類方法分別是形態學分類；解剖學分類；細胞學分類和分子系統學分類，其中形態學分類主要基于植物營養器官(根、莖、葉)或生殖器官(花、果實、種子)在形態上的差異來進行分類研究。其中花，果實和葉的形態學特征是山茶屬植物重要的分類依據，并發展出了三大分類系統:sealy系統、張宏達系統和閔天祿系統。解剖學分類是根據花粉形態(大小、形狀、外壁紋飾)和葉形態結構等解剖特征來進行分類的研究，這一分類手段在一定程度上是對傳統的形態學分類提供一些輔助證據。細胞學分類主要基于染色體數目、形態結構、細胞倍性、核型分析這幾個方面對山茶屬植物進行分類。隨著分子技術飛速發展，分子系統學分類為山茶屬植物分類提供了較有力的證據。通常高等植物具有3套基因組即核基因組；線粒體基因組和葉綠體基因組，基于這3套基因組dna序列的研究為山茶屬植物分類帶來了長足的發展。>
3、最近在所有的山茶屬茶組(thea)植物的基因組中都發現了一條命名為cata的t-dna序列，并且根據cata的序列差異信息，共分型得到了225個cata等位基因序列以及2種cata結構。cata序列保守性能夠反應生物物種的親緣關系，為系統發育重建提供線索；序列可變性則能夠揭示出生物物種的特征核酸序列，是茶組植物種屬鑒定的重要基礎。因此，本領域的技術人員致力于開發一種基于t-dna序列信息得準確的對山茶屬茶組植物種屬的鑒定方法。
技術實現思路
1、有鑒于現有技術的上述缺陷，本專利技術所要解決的技術問題是提供一種準確的對山茶屬茶組植物種屬的鑒定方法。
2、為實現上述目的，本專利技術提供了一種以t-dna作為分子標記鑒定山茶屬茶組植物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
3、步驟1、提取茶組植物葉片基因組；
4、步驟2、擴增葉片基因組中的t-dna片段；
5、步驟3、純化擴增產物后測序，并與先前構建的茶組植物的t-dna序列差異表進行比對，獲取準確種屬鑒定結果。
6、在本專利技術的較佳實施方式中，所述步驟1采用改良的ctab法提取茶組植物葉片基因組。
7、在本專利技術的另一較佳實施方式中，所述改良的ctab法具體包括如下步驟：
8、步驟1.1、將1g凍葉片或新鮮葉片剪碎放入預冷的研缽中，加入液氮研磨，將研磨好的葉片轉入含有5ml提取緩沖液的10ml離心管中，充分渦旋混勻；
9、步驟1.2、離心機4℃預冷后9000rpm離心20min，棄上清；在剩余沉淀中加入4ml?65℃預熱的裂解緩沖液渦旋混勻，65℃水浴40min，期間顛倒混勻，充分裂解；
10、步驟1.3、水浴結束后加入4ml的體積比為24：1的氯仿和異戊醇的混合液，翻轉50次以上，靜置5min，10000rpm離心20min，將上清轉入新的10ml離心管中，避免吸取沉淀，加入上清液0.6倍體積的預冷的異丙醇，緩慢翻轉混勻，靜置10min，10000rpm，室溫離心10min，棄上清，于沉淀中加入2ml?70％的乙醇洗滌，10000rpm離心2min，倒掉上清液，通風干燥直到沉淀變透明為止；
11、步驟1.4、在10ml離心管中加3ml?te緩沖液溶解，te緩沖液為10mm?ph
12、8.0tris/hcl，1mm?ph?8.0edta，65℃孵育10～30min后，加入rnasea，37℃孵育30min后，加等體積的體積比為24：1的氯仿和異戊醇，緩慢翻轉混勻，室溫靜置5min，10000rpm離心10min；
13、步驟1.5、小心吸取上清液轉入10ml離心管中，加入上清液0.2倍體積的5m?nacl溶液，加入上清液2倍體積預冷的無水乙醇，翻轉混勻，放置10min，10000rpm離心10min，棄上清液，加2ml?70％乙醇洗dna沉淀，10000rpm離心2min，倒掉上清液，通風干燥直至透明；
14、步驟1.6、在4℃下加200μl?te緩沖液溶解dna1～2天，-20℃保存。
15、在本專利技術的另一較佳實施方式中，所述步驟2中的t-dna片段為cata基因片段。
16、在本專利技術的另一較佳實施方式中，用擴增引物cata-f2-1和cata-r2-1對樣品dna中的cata區進行擴增，獲得pcr產物，其中引物對的核苷酸序列如下：
17、seq?id?no.1cata-f1-1：5’-acgtcgcatttttacgacct-3’
18、seq?id?no.2cata-r1-1：5’-tcctcaagtctatcgcagtg-3’。
19、在本專利技術的另一較佳實施方式中，所述步驟2的擴增pcr反應體系為：25μl?kod高保真dna聚合酶，10um的上下游擴增引物各2μl，模板1μl，20μl無酶水，總體積為50μl。
20、在本專利技術的另一較佳實施方式中，所述步驟2的擴增pcr反應程序為：預變性98℃3min，變性98℃10s，退火55℃10s，延伸68℃5-10s/kb、33個循環，終延伸68℃5min，4℃保存。
21、在本專利技術的另一較佳實施方式中，所述步驟3的t-dna序列差異表具體根據統計的不同茶組植物的所有cata等位基因序列中的獨特變異堿基信息而構建。
22、在本專利技術的另一較佳實施方式中，所述不同茶組植物包括舒茶早、白茶1號和龍井43，以舒茶早cata全長序列為參考序列并列出差異堿基位點，其中舒茶早cata序列全長序列如seq?id?no.3所示。
23、在本專利技術的另一較佳實施方式中，所述步驟3具體包括，將擴增產物純化后，采用擴增引物進行測序反應，將測序結果與先前構建的茶組植物的t-dna序列差異表進行比對，獲取準確種屬鑒定結果。
24、技術效果
25、本專利技術通過t-dna序列的存在與否鑒定科屬，t-dna序列是明確、高度特異性且易于識別的dna片段，且t-dna插入片段在插入后不會在基因組中擴增和傳播。茶組植物存在大量的雜交現象，t-dna序列長度足夠長且插入時間足夠古老，因此足以產生一系列變體，通過t-dna序列的snp差異鑒定品種，使得鑒定結果更加準確。
26、以下將結合附圖對本專利技術的構思、具體結構及產生的技術效果作進一步本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種以T-DNA作為分子標記鑒定山茶屬茶組植物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1采用改良的CTAB法提取茶組植物葉片基因組。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述改良的CTAB法具體包括如下步驟：
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中的T-DNA片段為CaTA基因片段。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，用擴增引物CaTA-F2-1和CaTA-R2-1對樣品DNA中的CaTA區進行擴增，獲得PCR產物，其中引物對的核苷酸序列如下：
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2的擴增PCR反應體系為：25μL?KOD高保真DNA聚合酶，10uM的上下游擴增引物各2μL，模板1μL，20μL無酶水，總體積為50μL。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2的擴增PCR反應程序為：預變性98℃3min，變性98℃10s，退火55℃10s，延伸68℃5-10s/kb、33個循環，終延伸68℃5min，4℃保
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3的T-DNA序列差異表具體根據統計的不同茶組植物的所有CaTA等位基因序列中的獨特變異堿基信息而構建。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述不同茶組植物包括舒茶早、白茶1號和龍井43，以舒茶早CaTA全長序列為參考序列并列出差異堿基位點，其中舒茶早CaTA序列全長序列如SEQ?ID?NO.3所示。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3具體包括，將擴增產物純化后，采用擴增引物進行測序反應，將測序結果與先前構建的茶組植物的T-DNA序列差異表進行比對，獲取準確種屬鑒定結果。
...【技術特征摘要】
1.一種以t-dna作為分子標記鑒定山茶屬茶組植物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1采用改良的ctab法提取茶組植物葉片基因組。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述改良的ctab法具體包括如下步驟：
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中的t-dna片段為cata基因片段。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，用擴增引物cata-f2-1和cata-r2-1對樣品dna中的cata區進行擴增，獲得pcr產物，其中引物對的核苷酸序列如下：
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2的擴增pcr反應體系為：25μl?kod高保真dna聚合酶，10um的上下游擴增引物各2μl，模板1μl，20μl無酶水，總體積為50μl。
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳可，劉海，王衛青，李佳妮，
申請(專利權)人：上海辰山植物園，
類型：發明
國別省市：
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