【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)，涉及一種表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、豬圓環(huán)病毒(pcv)是單鏈環(huán)狀dna病毒，屬于圓環(huán)病毒科，是已知最小的動物病毒之一。pcv基于全基因組核苷酸序列可分為四個血清型：pcv1、pcv2、pcv3和pcv4。其中，pcv2最具臨床意義，可細(xì)分為a至h八個亞型，這些基因型在致病性、抗原特性上可能存在差異。截至目前，pcv2已經(jīng)經(jīng)歷了兩次重要的抗原變異事件：第一次是在2003年，當(dāng)時pcv2b亞型取代了pcv2a亞型成為全球范圍內(nèi)的主要毒株；第二次則發(fā)生在2012年左右，pcv2d亞型開始取代pcv2b亞型成為新的主導(dǎo)毒株。
2、pcv2的cap蛋白是主要的免疫原性成分，在引發(fā)宿主免疫反應(yīng)方面起著至關(guān)重要的作用，是研制pcv2基因工程疫苗的理想靶抗原。研究表明，cap蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和特異性抗體，并且可以誘導(dǎo)良好的細(xì)胞免疫反應(yīng)，在預(yù)防和控制pcv2中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
3、jev復(fù)制子是一種rna復(fù)制子，rna復(fù)制子是一種具備自我復(fù)制能力的rna載體，它保留了病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，同時結(jié)構(gòu)蛋白基因被外源抗原基因所取代。復(fù)制/轉(zhuǎn)錄酶負(fù)責(zé)調(diào)控載體rna在細(xì)胞質(zhì)中的高效復(fù)制以及外源基因的高效表達(dá)。利用黃病毒屬病毒感染性克隆，成功構(gòu)建了復(fù)制子載體。需要注意的是在插入外源基因時，應(yīng)盡量減少對病毒基因組的改動，以防止外源基因無法表達(dá)或在傳代過程中逐漸丟失編碼序列，從而影響其功能。豬圓環(huán)病毒(pcv)的cap蛋白具有顯著的免疫原性，適合作為制
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)中尚未成功構(gòu)建出能夠高效表達(dá)pcv?cap蛋白編碼基因的復(fù)制子表達(dá)載體的技術(shù)不足，本專利技術(shù)提供一種表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建方法與應(yīng)用，其采用基因i型日本腦炎病毒的基因組，該基因組已缺失c、prm和e結(jié)構(gòu)蛋白基因，在缺失的結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域嵌入豬圓環(huán)病毒2型的cap蛋白基因，從而成功構(gòu)建了能夠高效表達(dá)pcv2?cap蛋白的pjev-cmv-pcv2a?cap、pjev-cmv-pcv2b?cap、pjev-cmv-pcv2d?cap復(fù)制子質(zhì)粒。這些質(zhì)粒不僅具備復(fù)制功能，而且能夠高效表達(dá)pcv2?cap蛋白，為pcv疫苗的研發(fā)提供了新的策略和方法。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案：
3、一種表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒，其是以利用基因i型日本腦炎病毒的基因組作為載體骨架，嵌入了豬圓環(huán)病毒2型的cap蛋白基因而獲得，其中所述載體骨架中c、prm和e結(jié)構(gòu)蛋白基因缺失。
4、上述所述的表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒中，所述的載體骨架為pjev-cmv-b602l復(fù)制子質(zhì)粒，所述的pjev-cmv-b602l的核酸序列如seq?id?no.13所示。
5、上述所述的表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒中，所述的豬圓環(huán)病毒2型的cap蛋白基因?yàn)閟eq?id?no.4所示的pcv2a?cap蛋白序列、seq?id?no.5所示的pcv2b?cap蛋白序列和seq?id?no.6所示的pcv2d?cap蛋白序列中的一種，且在豬圓環(huán)病毒2型的cap蛋白基因序列的5'端均附加了ha標(biāo)簽。
6、所述表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒為pjev-cmv-pcv2a?cap、pjev-cmv-pcv2b?cap和pjev-cmv-pcv2d?cap復(fù)制子質(zhì)粒中的一種，其中pjev-cmv-pcv2a?cap的核酸序列如seq?id?no.1所示、pjev-cmv-pcv2b?cap的核酸序列如seq?id?no.2所示，pjev-cmv-pcv2d?cap的核酸序列如seq?id?no.3所示。
7、本專利技術(shù)提供了一套用于表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒的引物組，所述的引物組包括用于擴(kuò)增pcv2a?cap蛋白的正向引物pcv2a-cap-f和反向引物pcv2a-cap-r，用于擴(kuò)增pcv2b?cap蛋白的正向引物pcv2b-cap-f和反向引物pcv2b-cap-r，以及用于擴(kuò)增pcv2dcap蛋白的正向引物pcv2d-cap-f和反向引物pcv2d-cap-r。其中，正向引物pcv2a-cap-f的序列如seq?id?no.7所示，反向引物pcv2a-cap-r的序列如seq?id?no.8所示；正向引物pcv2b-cap-f的序列如seq?id?no.9所示，反向引物pcv2b-cap-r的序列如seq?id?no.10所示；正向引物pcv2d-cap-f的序列如seq?id?no.11所示，反向引物pcv2d-cap-r的序列如seqid?no.12所示。
8、本專利技術(shù)還提供了一種表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒的制備方法，包括以下步驟：
9、s1.pcv2a?cap蛋白序列的合成與擴(kuò)增：分別合成seq?id?no.4所示的pcv2a?cap蛋白序列、seq?id?no.5所示的pcv2b?cap蛋白序列和seq?id?no.6所示的pcv2d?cap蛋白序列，使用對應(yīng)的引物組分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增。
10、s2.將pjev-cmv-b602l復(fù)制子質(zhì)粒經(jīng)過claⅰ和mluⅰ雙酶切處理，獲得雙酶切載體片段1；將pjev-cmv-b602l復(fù)制子質(zhì)粒經(jīng)過bamhⅰ和mluⅰ雙酶切處理，獲得雙酶切載體片段2；
11、s3.同源重組連接：將擴(kuò)增得到的pcv2a?cap蛋白序列與雙酶切載體片段1進(jìn)行同源重組連接，得到重組質(zhì)粒pjev-cmv-pcv2a?cap；將擴(kuò)增得到的pcv2b?cap蛋白序列與雙酶切載體片段1進(jìn)行同源重組連接，得到重組質(zhì)粒pjev-cmv-pcv2b?cap；將擴(kuò)增得到的pcv2dcap蛋白序列與雙酶切載體片段2進(jìn)行同源重組連接，得到重組質(zhì)粒pjev-cmv-pcv2d?cap。
12、上述所述的表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒的制備方法中，所述s3步驟中的同源重組連接過程中使用諾唯贊同源重組試劑盒c115進(jìn)行同源重組。
13、本專利技術(shù)還請求保護(hù)上述表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒在制備豬圓環(huán)病毒2型疫苗中的用途。
14、通過上述技術(shù)方案，本專利技術(shù)具有如下有益效果：本專利技術(shù)創(chuàng)造性地利用基因i型日本腦炎病毒的基因組作為載體骨架，其中c、prm和e結(jié)構(gòu)蛋白基因已被刪除。在上述基因缺失位點(diǎn)處，本專利技術(shù)嵌入了豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)的cap蛋白基因，由此成功構(gòu)建了一系列復(fù)制子質(zhì)粒，包括pjev-cmv-pcv2a?cap、pjev-cmv-pcv2b?cap以及pjev-cmv-pcv2d?cap。所述質(zhì)粒不僅具備自我復(fù)制的能力，還能高效表達(dá)pcv2的cap蛋白，從而為開發(fā)針對豬圓環(huán)病毒2型的有效疫苗提供了創(chuàng)新的技術(shù)方本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種表達(dá)PCV2?Cap蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒，其是以利用基因I型日本腦炎病毒的基因組作為載體骨架，嵌入了豬圓環(huán)病毒2型的Cap蛋白基因而獲得，其中所述載體骨架中C、prM和E結(jié)構(gòu)蛋白基因缺失。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)PCV2?Cap蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒，其特征在于，所述的載體骨架為pJEV-CMV-B602L復(fù)制子質(zhì)粒，所述的pJEV-CMV-B602L的核酸序列如SEQ?ID?NO.13所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)PCV2?Cap蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒2型的Cap蛋白基因?yàn)镾EQ?ID?NO.4所示的PCV2a?Cap蛋白序列、SEQ?ID?NO.5所示的PCV2b?Cap蛋白序列和SEQ?ID?NO.6所示的PCV2d?Cap蛋白序列中的一種，且在豬圓環(huán)病毒2型的Cap蛋白基因序列的5'端均附加了HA標(biāo)簽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)PCV2?Cap蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒，其特征在于，所述表達(dá)PCV2?Cap蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒為pJEV-CMV-PCV2a?Cap、pJEV-CMV-
5.一套用于權(quán)利要求1-3所述的表達(dá)PCV2?Cap蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒的引物組，其特征在于，所述的引物組包括用于擴(kuò)增PCV2a?Cap蛋白的正向引物PCV2a-Cap-F和反向引物PCV2a-Cap-R，用于擴(kuò)增PCV2b?Cap蛋白的正向引物PCV2b-Cap-F和反向引物PCV2b-Cap-R，以及用于擴(kuò)增PCV2d?Cap蛋白的正向引物PCV2d-Cap-F和反向引物PCV2d-Cap-R，其中，正向引物PCV2a-Cap-F的序列如SEQ?ID?NO.7所示，反向引物PCV2a-Cap-R的序列如SEQ?ID?NO.8所示；正向引物PCV2b-Cap-F的序列如SEQ?ID?NO.9所示，反向引物PCV2b-Cap-R的序列如SEQ?ID?NO.10所示；正向引物PCV2d-Cap-F的序列如SEQ?ID?NO.11所示，反向引物PCV2d-Cap-R的序列如SEQ?ID?NO.12所示。
6.一種表達(dá)PCV2?Cap蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)PCV2?Cap蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，所述S3步驟中的同源重組連接過程中使用諾唯贊同源重組試劑盒C115進(jìn)行同源重組。
8.權(quán)利要求1-4任一所述的表達(dá)PCV2?Cap蛋白的JEV復(fù)制子質(zhì)粒在制備豬圓環(huán)病毒2型疫苗中的用途。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒，其是以利用基因i型日本腦炎病毒的基因組作為載體骨架，嵌入了豬圓環(huán)病毒2型的cap蛋白基因而獲得，其中所述載體骨架中c、prm和e結(jié)構(gòu)蛋白基因缺失。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒，其特征在于，所述的載體骨架為pjev-cmv-b602l復(fù)制子質(zhì)粒，所述的pjev-cmv-b602l的核酸序列如seq?id?no.13所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒，其特征在于，所述的豬圓環(huán)病毒2型的cap蛋白基因?yàn)閟eq?id?no.4所示的pcv2a?cap蛋白序列、seq?id?no.5所示的pcv2b?cap蛋白序列和seq?id?no.6所示的pcv2d?cap蛋白序列中的一種，且在豬圓環(huán)病毒2型的cap蛋白基因序列的5'端均附加了ha標(biāo)簽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒，其特征在于，所述表達(dá)pcv2?cap蛋白的jev復(fù)制子質(zhì)粒為pjev-cmv-pcv2a?cap、pjev-cmv-pcv2b?cap和pjev-cmv-pcv2d?cap復(fù)制子質(zhì)粒中的一種，其中pjev-cmv-pcv2a?cap的核酸序列如seq?id?no.1所示、pjev-cmv-pcv2b?cap的核酸序列如seq?id?no.2所示，pjev-cmv-pcv2d?cap的核酸...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：邱亞峰，馬志永，魏建超，李家俊，彭盼盼，肖長廣，劉珂，李蓓蓓，李宗杰，邵東華，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心上海分中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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