【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于基因工程和重組病毒疫苗，具體涉及攜帶旋毛蟲(chóng)clp基因的腺病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、旋毛蟲(chóng)病是由旋毛形線蟲(chóng)引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患食源性寄生蟲(chóng)病，主要因生食或半生食含有旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)包囊的肉類(lèi)所致，在哺乳動(dòng)物之間廣泛傳播。旋毛蟲(chóng)病呈世界性廣泛分布，尤其是歐洲及北美流行較為嚴(yán)重，國(guó)內(nèi)旋毛蟲(chóng)病呈現(xiàn)局部性和暴發(fā)性感染流行的特點(diǎn)，以云南、西藏與河南等地發(fā)病報(bào)道較多。鑒于旋毛蟲(chóng)病對(duì)公共衛(wèi)生的危害，歐盟將其列為15種重要人獸共患病病種與a類(lèi)強(qiáng)制性報(bào)告病種，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（woah）則將其列為屠宰生豬強(qiáng)制性必檢病種，我國(guó)于2022年再次將其列為人畜共患傳染病目錄關(guān)鍵病種。旋毛蟲(chóng)病不僅給公共健康和食品安全造成嚴(yán)重威脅，也給動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重問(wèn)題。目前針對(duì)旋毛蟲(chóng)病缺乏有效預(yù)防手段，因此，疫苗研發(fā)成為防控旋毛蟲(chóng)病的重要手段之一。
2、然而，旋毛蟲(chóng)獨(dú)特的病原生物學(xué)與免疫學(xué)特性導(dǎo)致疫苗研發(fā)困難，究其原因在于旋毛蟲(chóng)不同于簡(jiǎn)單病原如細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)及真菌等，它可快速引發(fā)宿主ii型免疫反應(yīng)（抗炎/抑炎反應(yīng)），抑制疫苗或感染免疫記憶的喚醒，從而導(dǎo)致宿主疫苗免疫失敗或發(fā)生再次感染。旋毛蟲(chóng)生活史復(fù)雜，成蟲(chóng)主要寄生于小腸內(nèi)，通過(guò)攝取食物維持生命，并產(chǎn)生幼蟲(chóng)。這些幼蟲(chóng)隨后通過(guò)淋巴或血液循環(huán)被帶到全身，但只有到達(dá)橫紋肌的幼蟲(chóng)才能繼續(xù)發(fā)育。然而，在幼蟲(chóng)進(jìn)入血液循環(huán)并嘗試到達(dá)橫紋肌之前，它們必須先突破腸道黏膜的屏障。腸道黏膜的完整性和防御功能對(duì)于阻止旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的入侵至關(guān)重要。一旦幼蟲(chóng)突破腸道黏膜屏障，它們就能隨血液流動(dòng)到全身各器官
3、隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，多類(lèi)型疫苗策略并行研發(fā)是動(dòng)物旋毛蟲(chóng)病疫苗研制的重要方向。目前動(dòng)物旋毛蟲(chóng)病疫苗研究大致可以分為四個(gè)類(lèi)型：致弱疫苗、天然抗原疫苗、重組蛋白疫苗和dna疫苗。然而，這些疫苗需接種2-3劑次，且不能達(dá)到長(zhǎng)期有效的保護(hù)。因此，鑒于動(dòng)物出欄時(shí)效性要求，亟需研發(fā)一劑次便能達(dá)到高效免疫水平的旋毛蟲(chóng)病疫苗。病毒載體疫苗作為一種新型疫苗研究策略已被廣泛關(guān)注，20世紀(jì)80年代利用表達(dá)乙型肝炎病毒（hbv）表面抗原的重組痘苗病毒成功研制了第1種病毒載體疫苗。目前，腺病毒載體作為疫苗研發(fā)中最廣泛應(yīng)用的病毒載體之一，可通過(guò)簡(jiǎn)單改變遞送的核酸序列快速研發(fā)新型疫苗，具有轉(zhuǎn)基因效率高、安全性高、無(wú)需佐劑、可以多種途徑接種等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用，如獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)文號(hào)的重組埃博拉病毒病疫苗（腺病毒載體）與重組新型冠狀病毒疫苗（5型腺病毒載體）。值得注意的是，利用人血清5型復(fù)制缺陷型腺病毒載體把新冠病毒（sars-cov-2）s蛋白的基因整合至腺病毒基因組中，成功研發(fā)了肌注型和吸入型腺病毒載體新冠病毒疫苗，為有效應(yīng)對(duì)未來(lái)可能出現(xiàn)的新發(fā)傳染病流行積累了更多經(jīng)驗(yàn)，也為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的疫苗研發(fā)提供了新的思路和策略。此外，重組腺病毒載體疫苗已應(yīng)用于豬、雞、貓等動(dòng)物中，這更進(jìn)一步驗(yàn)證了腺病毒載體疫苗作為動(dòng)物寄生蟲(chóng)新型疫苗的可行性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決現(xiàn)有旋毛蟲(chóng)疫苗需接種2-3劑次，且不具有長(zhǎng)期有效性的技術(shù)問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種攜帶旋毛蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶抑制劑樣蛋白（cystatin-like?protein，clp）基因的重組腺病毒載體、重組腺病毒及其構(gòu)建方法與其在制備旋毛蟲(chóng)病重組腺病毒載體疫苗中的應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)提供的重組腺病毒載體的設(shè)計(jì)核心在于利用在旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄且在6?h腸道感染性肌幼蟲(chóng)時(shí)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最大的clp蛋白作為抗原，通過(guò)基因重組技術(shù)將其整合至腺病毒載體中；本專(zhuān)利技術(shù)將獲得的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染至hek293a細(xì)胞，經(jīng)包裝、擴(kuò)增及反復(fù)凍融得到重組腺病毒，并通過(guò)多個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了重組腺病毒rad5tsclp在hek293a細(xì)胞中表達(dá)旋毛蟲(chóng)clp基因和蛋白，其形態(tài)與野生腺病毒ad5neg無(wú)差異，目的基因插入穩(wěn)定，未影響重組腺病毒的生物學(xué)特性；此外，本專(zhuān)利技術(shù)還通過(guò)免疫動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明利用重組腺病毒rad5tsclp免疫小鼠具有有效抵抗旋毛蟲(chóng)感染的效果，為后續(xù)旋毛蟲(chóng)病疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
2、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，并實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的技術(shù)效果，本專(zhuān)利技術(shù)提出了如下技術(shù)方案：
3、本專(zhuān)利技術(shù)的第一個(gè)目的是提供一種攜帶旋毛蟲(chóng)clp基因的重組腺病毒載體，所述重組腺病毒載體由復(fù)制缺陷型腺病毒骨架質(zhì)粒與攜帶旋毛蟲(chóng)clp基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒進(jìn)行同源重組獲得；所述復(fù)制缺陷型腺病毒骨架質(zhì)粒為padeasy-1，所述旋毛蟲(chóng)clp基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、旋毛蟲(chóng)clp基因是本課題組在旋毛蟲(chóng)感染后6?h的腸道感染性幼蟲(chóng)cdna文庫(kù)中篩選獲得的高豐度強(qiáng)抗原性基因，其編碼半胱氨酸蛋白酶抑制劑。半胱氨酸蛋白酶抑制劑不僅能夠調(diào)節(jié)寄生蟲(chóng)體內(nèi)組織蛋白酶、木瓜蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶類(lèi)的活性，維持其生理平衡，還可能參與寄生蟲(chóng)與宿主之間的相互作用，影響寄生蟲(chóng)的入侵、寄生及逃避宿主免疫等過(guò)程。此外，clp蛋白抑制樹(shù)突狀細(xì)胞（dcs）抗原提呈，阻礙t細(xì)胞激活分化，有助于旋毛蟲(chóng)逃避免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期寄生。同時(shí)，它抑制免疫細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子（如il-6、il-12、tnf-α），促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子（如il-10）分泌，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減輕損傷。clp蛋白還抑制樹(shù)突狀細(xì)胞遷移，限制其與t細(xì)胞、b細(xì)胞接觸，抑制免疫突觸建立和獲得性免疫應(yīng)答啟動(dòng)。
5、本專(zhuān)利技術(shù)的第二個(gè)目的是提供上述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括如下步驟：
6、（1）采用核苷酸序列如seq?id?no.2和seq?id?no.3所述的引物擴(kuò)增獲得旋毛蟲(chóng)clp基因片段；
7、（2）將步驟（1）擴(kuò)增獲得的旋毛蟲(chóng)clp基因片段連接到穿梭質(zhì)粒中，并將所得連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，提取獲得重組穿梭質(zhì)粒；
8、（3）將步驟（2）提取獲得的重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，獲得線性化重組穿梭質(zhì)粒，將線性化重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到已經(jīng)攜帶padeasy-1質(zhì)粒的大腸桿菌bj5183中進(jìn)行同源重組，經(jīng)卡那霉素篩選獲得重組腺病毒載體。
9、在本專(zhuān)利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，步驟（2）所述穿梭質(zhì)粒為pshuttle-cmv，所述大腸桿菌為大腸桿菌dh5α。
10、本專(zhuān)利技術(shù)的第三個(gè)目的是提供上述重組腺病毒載體的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將上述重組腺病毒載體用于制備防治旋毛蟲(chóng)病的生物制品。
11、本專(zhuān)利技術(shù)的第四個(gè)目的是提供一種攜帶旋毛蟲(chóng)clp基因的重組腺病毒，所述重組腺病毒由上述的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得。
12、在本專(zhuān)利技術(shù)的一種實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為hek293a細(xì)胞。
13、本專(zhuān)利技術(shù)的第五個(gè)目的是提供上述重組腺病毒的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：
14、將上述的重組腺病毒載體線性化后轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)行重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增，收集病變的細(xì)胞后經(jīng)反復(fù)凍融得到重組腺病毒。
15、在本專(zhuān)利技術(shù)的一種實(shí)施方式中本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種攜帶旋毛蟲(chóng)CLP基因的重組腺病毒載體，其特征在于，所述重組腺病毒載體由復(fù)制缺陷型腺病毒骨架質(zhì)粒與攜帶旋毛蟲(chóng)CLP基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒進(jìn)行同源重組獲得；所述復(fù)制缺陷型腺病毒骨架質(zhì)粒為pAdEasy-1，所述旋毛蟲(chóng)CLP基因的核苷酸序列如SEQID?NO.1所示。
2.權(quán)利要求1所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）所述穿梭質(zhì)粒為pShuttle-CMV，所述大腸桿菌為大腸桿菌DH5α。
4.權(quán)利要求1所述重組腺病毒載體的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1所述重組腺病毒載體用于制備防治旋毛蟲(chóng)病的生物制品。
5.一種攜帶旋毛蟲(chóng)CLP基因的重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒由權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組腺病毒，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為HEK293A細(xì)胞。
7.權(quán)利要求5或6任一所述重組腺病毒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體線
8.權(quán)利要求5或6任一所述重組腺病毒的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為將權(quán)利要求5或6任一所述重組腺病毒用于制備防治旋毛蟲(chóng)病的生物制品。
9.一種旋毛蟲(chóng)病重組腺病毒載體疫苗，其特征在于，所述旋毛蟲(chóng)病重組腺病毒載體疫苗以權(quán)利要求5或6任一所述的重組腺病毒作為抗原制備。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的旋毛蟲(chóng)病重組腺病毒載體疫苗，其特征在于，所述旋毛蟲(chóng)病重組腺病毒載體疫苗的免疫方式為肌肉注射免疫或滴鼻免疫。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種攜帶旋毛蟲(chóng)clp基因的重組腺病毒載體，其特征在于，所述重組腺病毒載體由復(fù)制缺陷型腺病毒骨架質(zhì)粒與攜帶旋毛蟲(chóng)clp基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒進(jìn)行同源重組獲得；所述復(fù)制缺陷型腺病毒骨架質(zhì)粒為padeasy-1，所述旋毛蟲(chóng)clp基因的核苷酸序列如seqid?no.1所示。
2.權(quán)利要求1所述重組腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）所述穿梭質(zhì)粒為pshuttle-cmv，所述大腸桿菌為大腸桿菌dh5α。
4.權(quán)利要求1所述重組腺病毒載體的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1所述重組腺病毒載體用于制備防治旋毛蟲(chóng)病的生物制品。
5.一種攜帶旋毛蟲(chóng)clp基因的重組腺病毒，其特征在于，所述重組腺病毒由權(quán)利要求1所述的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：白雪，宿諾，王洋，劉明遠(yuǎn)，徐凝，楊勇，唐斌，丁靜，劉曉雷，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：吉林大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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