【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種高效多酶共固定級(jí)聯(lián)的方法及其應(yīng)用于d-阿洛酮糖的制備，屬于酶工程領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
1、d-阿洛酮糖是d-果糖的c-3差向異構(gòu)體，在小麥中以游離糖的形式存在。d-阿洛酮糖除具有低能量、改善腸道菌群、抗齲齒等生理功能外，還在抑制血糖升高與體脂積累、清除自由基、神經(jīng)保護(hù)等諸多方面發(fā)揮著重要生理作用。d-阿洛酮糖甜度可達(dá)到蔗糖的70％，能量只有蔗糖的10％，是一種新型甜味劑，尤其適用于糖尿病及肥胖癥人群，它可被小腸吸收，通過尿液排出體外。2011年，d-阿洛酮糖被美國(guó)fda認(rèn)定為公認(rèn)安全(gras)的食品，允許其添加到食品中。自此d-阿洛酮糖得到了迅速發(fā)展，市場(chǎng)上出現(xiàn)了多種含d-阿洛酮糖的產(chǎn)品，它們作為特殊人群(如糖尿病患者、肥胖人群)的功能性食品在市場(chǎng)中受到廣泛歡迎。
2、d-阿洛酮糖的合成主要有兩種方法：化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。d-阿洛酮糖的化學(xué)合成比較困難，以鉬酸鹽為催化劑，反應(yīng)溫度維持在80-120℃，該過程副產(chǎn)物較多，同時(shí)化學(xué)合成法還存在環(huán)境污染嚴(yán)重、立體選擇性低等問題。因此d-阿洛酮糖的合成主要依賴于生物轉(zhuǎn)化法。生物轉(zhuǎn)化法主要是運(yùn)用酶的催化反應(yīng)生成d-阿洛酮糖。與化學(xué)合成法相比，生物轉(zhuǎn)化法有易于操作，無其他副產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)。生物轉(zhuǎn)化法主要包括兩種：(1)利用磷酸二羥丙酮(dhap)依賴性醛縮酶合成d-阿洛酮糖，dhap可在醛縮酶的作用下與d/l-甘油醛反應(yīng)生成磷酸糖，后經(jīng)磷酸酶作用可脫磷酸化為各種稀有糖，如d/l-阿洛酮糖、d/l-塔格糖等；(2)采用izumoring策略合成d-阿洛酮糖。d-阿洛
3、單酶酶法生產(chǎn)的d-阿洛酮糖存在產(chǎn)量低，不易分離等問題，且酶價(jià)格較昂貴，這些已成為制約d-阿洛酮糖高效制備的主要瓶頸，通過多酶級(jí)聯(lián)固定化技術(shù)則可有效解決這些問題。多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)是一種生物催化過程，通過多種酶的協(xié)同作用將一個(gè)底物轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物。這種反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜化學(xué)轉(zhuǎn)化的可控性和高效性，具有廣泛的應(yīng)用前景。在多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，多個(gè)酶按照一定的順序聯(lián)結(jié)在一起，通過酶底物、酶-酶互作、輔助因子等多種機(jī)制有機(jī)結(jié)合，從而提高產(chǎn)物得率和純度，縮短反應(yīng)時(shí)間等；固定化酶指借助載體材料將酶固定于一定空間內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，能有效抵抗環(huán)境改變對(duì)酶活性的影響，同時(shí)易于酶的回收使用，簡(jiǎn)化后續(xù)分離純化步驟，實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用。因此，開發(fā)一種高效實(shí)用的多酶固定化級(jí)聯(lián)生產(chǎn)d-阿洛酮糖能大大降低生產(chǎn)成本。
4、現(xiàn)在技術(shù)中采用了多種方法實(shí)現(xiàn)級(jí)聯(lián)生產(chǎn)d-阿洛酮糖，例如中國(guó)專利cn117646046a公開了一種利用雙酶級(jí)聯(lián)重組枯草芽孢桿菌催化d-葡萄糖生物合成d-阿洛酮糖的方法，成功實(shí)現(xiàn)了雙酶級(jí)聯(lián)合成d-阿洛酮糖，但是其整體的轉(zhuǎn)化率只有15％。因此，急需尋找一種可以高效制備酶活性穩(wěn)定的且可多次重復(fù)利用的多酶固定化級(jí)聯(lián)生產(chǎn)d-阿洛酮糖的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供了一種多酶共固定級(jí)聯(lián)合成d-阿洛酮糖的方法，目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)缺乏可以高效制備酶活性穩(wěn)定的且可多次重復(fù)利用的多酶固定化級(jí)聯(lián)生產(chǎn)d-阿洛酮糖的方法的技術(shù)問題。
2、本專利技術(shù)提供的第一個(gè)技術(shù)方案一種新型固定化載體的制備方法，所述方法為在fe3o4納米顆粒的表面覆蓋一層沸石咪唑骨架(zif-8)的外殼，然后利用3-氨丙基三乙氧基硅烷與戊二醛引入醛基，最后利用nα,nα-雙(羧甲基)-l-賴氨酸引入nta，最終合成一種nta功能化的磁性納米顆粒，即固定化載體。
3、在一種實(shí)施方式中，所述方法包括如下步驟：
4、(1)制備沸石咪唑骨架-8(zif-8)包被的磁性納米顆粒：將fe3o4溶解于聚苯乙烯磺酸鈉(pss)溶液中，然后室溫下超聲并攪拌均勻，30min后用磁鐵回收納米顆粒，用甲醇洗滌，之后將磁性納米顆粒分散于甲醇中；然后向溶液中添加可溶性鋅鹽并攪拌10min，之后再向溶液中緩慢添加2-甲基咪唑攪拌4h，結(jié)束后磁鐵回收用乙醇洗滌3～4遍，然后低溫烘干；
5、(2)醛基修飾：取適量(1)中制備的磁性納米顆粒超聲分散于乙醇中，接著加入適量3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，攪拌反應(yīng)6h；反應(yīng)結(jié)束后，用純水洗滌數(shù)次后分散在適量純水中，然后邊攪拌邊緩慢加入適量50％戊二醛，攪拌3h得到醛基修飾的磁性納米顆粒，結(jié)束后磁鐵回收，純水洗滌3～4遍；
6、(3)次氮基三乙酸(nta)功能化：將(2)中洗滌過的磁性納米顆粒超聲分散于適量純水中，添加適量50mm，ph8的nα,nα-雙(羧甲基)-l-賴氨酸水合物溶液，攪拌24h，反應(yīng)結(jié)束后，用超純水洗滌3～4次，將洗滌完的磁性納米顆粒重懸于nicl2(50mm)水溶液中攪拌2h，然后純水洗滌3～4次，低溫烘干后得到次氮基三乙酸功能化的磁性納米顆粒。
7、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)中，所述fe3o4的粒徑為200nm，所述聚苯乙烯磺酸鈉溶液的濃度為0.3-0.5％w/v。
8、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)中，所述可溶性鋅鹽zn(no3)2，znso4或zncl2。
9、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)中，所述fe3o4與聚苯乙烯磺酸鈉溶液的添加比例為(3：2)-(2：1)(w/v)，fe3o4、甲醇、zn(no3)2和2-甲基咪唑的添加比例為(1：1：5：14)-(2：1：5：14)(w/v/w/w)。
10、在一種實(shí)施方式中，所述低溫烘干的溫度為40℃～50℃，所述低溫烘干的時(shí)間為12h。
11、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)中，所述(1)中制備的磁性納米顆粒與3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙醇的添加比例為(30：1：10)-(60：1：10)(w/v/v)，與純水和50％戊二醛的添加比例為(10：1：1)-(20：1：1)(w/v/v)。
12、在一種實(shí)施方式中，步驟(3)中，所述(2)中制備的磁性納米顆粒與純水和nα,nα-雙(羧甲基)-l-賴氨酸水合物溶液的添加比例為(20：5：1)-(40：5：1)(w/v/v)，與nicl2水溶液的添加比例為(4：1)-(6：1)(w/v)。
13、本專利技術(shù)提供的第二個(gè)技術(shù)方案為利用第一個(gè)技術(shù)方案所述的方法制備的固定化載體。
14、本專利技術(shù)提供的第三個(gè)技術(shù)方案為一種制備級(jí)聯(lián)固定化酶的方法，所述方法為將帶有組氨酸標(biāo)簽的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶、l-鼠李樹膠糖激酶、多聚磷酸鹽激酶與第二個(gè)技術(shù)方案所述的固定化載體混合孵育。
15、在一種實(shí)施方式中，帶有組氨酸標(biāo)簽的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶、l-鼠李樹膠糖激酶、多聚磷酸鹽激酶與固定化載體以(1:1:1:50)～(3:1:1:50)質(zhì)量比進(jìn)行混合。
16、在一種本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種制備級(jí)聯(lián)固定化酶的方法，其特征在于，所述方法為將帶有組氨酸標(biāo)簽的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶、L-鼠李樹膠糖激酶、多聚磷酸鹽激酶與固定化載體混合孵育；所述固定化載體的制備方法為在Fe3O4納米顆粒的表面覆蓋一層沸石咪唑骨架的外殼，然后利用3-氨丙基三乙氧基硅烷與戊二醛引入醛基，最后利用Nα,Nα-雙(羧甲基)-L-賴氨酸引入NTA，最終合成一種NTA功能化的磁性納米顆粒，即固定化載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述Fe3O4的粒徑為200nm，所述聚苯乙烯磺酸鈉溶液的濃度為0.3-0.5％w/v；所述Fe3O4與聚苯乙烯磺酸鈉溶液的添加比例為(3：2)-(2：1)(w/v)，F(xiàn)e3O4、甲醇、Zn(NO3)2和2-甲基咪唑的添加比例為(1：1：5：14)-(2：1：5：14)(w/v/w/w)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述(1)中制備的磁性納米顆粒與3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙醇的添加比例為(30：1：10)-(60
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述(2)中制備的磁性納米顆粒與純水和Nα,Nα-雙(羧甲基)-L-賴氨酸水合物溶液的添加比例為(20：5：1)-(40：5：1)(w/v/v)，與NiCl2水溶液的添加比例為(4：1)-(6：1)(w/v)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述低溫烘干的溫度為40℃～50℃，所述低溫烘干的時(shí)間為12h。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，帶有組氨酸標(biāo)簽的D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶、L-鼠李樹膠糖激酶、多聚磷酸鹽激酶與固定化載體以(1:1:1:50)～(3:1:1:50)質(zhì)量比進(jìn)行混合；孵育的時(shí)間為15～120min。
8.一種利用權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的方法制備得到級(jí)聯(lián)固定化酶。
9.一種制備D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法是以D-果糖為底物，利用權(quán)利要求8所述的級(jí)聯(lián)固定化酶作為催化劑，催化生成D-阿洛酮糖-1-磷酸，然后通過酸性磷酸酶去磷酸化得到D-阿洛酮糖。
10.權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的方法，或權(quán)利要求8所述的級(jí)聯(lián)固定化酶，或權(quán)利要求9所述的方法在制備含D-阿洛酮糖產(chǎn)品中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種制備級(jí)聯(lián)固定化酶的方法，其特征在于，所述方法為將帶有組氨酸標(biāo)簽的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶、l-鼠李樹膠糖激酶、多聚磷酸鹽激酶與固定化載體混合孵育；所述固定化載體的制備方法為在fe3o4納米顆粒的表面覆蓋一層沸石咪唑骨架的外殼，然后利用3-氨丙基三乙氧基硅烷與戊二醛引入醛基，最后利用nα,nα-雙(羧甲基)-l-賴氨酸引入nta，最終合成一種nta功能化的磁性納米顆粒，即固定化載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述fe3o4的粒徑為200nm，所述聚苯乙烯磺酸鈉溶液的濃度為0.3-0.5％w/v；所述fe3o4與聚苯乙烯磺酸鈉溶液的添加比例為(3：2)-(2：1)(w/v)，fe3o4、甲醇、zn(no3)2和2-甲基咪唑的添加比例為(1：1：5：14)-(2：1：5：14)(w/v/w/w)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述(1)中制備的磁性納米顆粒與3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙醇的添加比例為(30：1：10)-(60：1：10)(w/v/v)，與純水和50％戊二醛的添加比例為(10：1：1)-(20：1：1)(w...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：龍杰，王晨，李興飛，金征宇，周星，邱超，陳龍，焦愛權(quán)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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