【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，具體涉及一種r298l基因缺失非洲豬瘟病毒株的構(gòu)建及其作為疫苗的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、非洲豬瘟(african?swine?fever，asf)是由非洲豬瘟病毒(african?swine?fevervirus，asfv)感染引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物烈性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為法定報(bào)告a類動(dòng)物疫病。該病具有病程短、傳播快、病死率高達(dá)100％的特點(diǎn)。由于該病毒基因組巨大，編碼一百多種病毒蛋白，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前仍有接近50％的病毒蛋白與宿主的相互作用機(jī)制尚不清楚，增加了疫苗的研究難度，迄今為止尚無安全有效的疫苗可用。因此，探究非洲豬瘟病毒蛋白與宿主蛋白的相互作用機(jī)制，可以深入了解asfv的致病機(jī)理，挖掘病毒的毒力基因，為高效疫苗的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。
2、asfv是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，基因組為170-193kb的雙鏈dna，直徑約260nm，由類核、核心殼、內(nèi)膜、衣殼和外囊膜五層結(jié)構(gòu)組成，包含150-167個(gè)開放閱讀框，可以編碼超過150種病毒蛋白，包括超過50種結(jié)構(gòu)蛋白，100多種非結(jié)構(gòu)蛋白。非洲豬瘟病毒蛋白r298l是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該類激酶通過包括磷酸化修飾在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各種通路里關(guān)鍵接頭蛋白的活性和水平，控制細(xì)胞內(nèi)通路的激活，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、炎癥反應(yīng)，甚至凋亡，壞死等決定細(xì)胞命運(yùn)的過程，從而影響病毒的復(fù)制，目前尚無r298l基因缺失毒株的相關(guān)研究報(bào)道。
3、迄今為止，仍無有效的商品化疫苗可用，傳統(tǒng)的滅活疫苗沒有
4、l83l和r298l均能抑制干擾素通路的表達(dá)，但是已有文獻(xiàn)表明l83l敲除的非洲豬瘟病毒的毒力和野毒株一樣強(qiáng)，并不適用于減毒株的制備。而本專利技術(shù)通過基因工程技術(shù)在非洲豬瘟親本毒株asfv/cn/gs/2018中缺失了r298l基因，得到了一株高安全性的非洲豬瘟候選疫苗減毒株，降低了該病毒對(duì)豬的致病性，能夠顯著誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生抗體保護(hù)，可作為安全和有效的非洲豬瘟候選疫苗，具有極大的社會(huì)應(yīng)用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)的目的在于提供一種構(gòu)建非洲豬瘟減毒株的策略，所述策略是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
2、第一方面，本專利技術(shù)提供了通過在ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018中缺失r298l基因制備非洲豬瘟減毒株的應(yīng)用，所述ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018已于2020年12月21日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no：v202096。
3、優(yōu)選地，所述r298l基因序列如seq?id?no.1所示。
4、第二方面，本專利技術(shù)提供了通過在ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018中缺失r298l基因制備非洲豬瘟減毒疫苗的應(yīng)用，所述ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018已于2020年12月21日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no：v202096。
5、優(yōu)選地，所述r298l基因序列如seq?id?no.1所示。
6、第三方面，本專利技術(shù)提供了一種基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株，所述基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株為r298l基因缺失的ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018，所述ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018已于2020年12月21日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no：v202096。
7、優(yōu)選地，所述r298l基因序列如seq?id?no.1所示。
8、第四方面，本專利技術(shù)提供了上述第三方面所述的基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株在制備非洲豬瘟疫苗中的應(yīng)用。
9、第五方面，本專利技術(shù)提供了一種非洲豬瘟減毒疫苗，所述非洲豬瘟減毒疫苗包括上述第三方面所述的基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株。
10、第六方面，本專利技術(shù)提供了上述第三方面所述減毒非洲豬瘟病毒株的制備方法，所述方法為：通過基因工程手段將親本非洲豬瘟病毒株r298l基因的全部或部分核苷酸序列缺失使r298l基因編碼蛋白的功能喪失。
11、優(yōu)選地，所述方法為同源重組技術(shù)，所述方法包括以下步驟：
12、(1)設(shè)計(jì)asfv?r298l基因上下游序列作為左右同源重組臂，并分別克隆入puc19載體中，獲得重組轉(zhuǎn)移載體；
13、(2)在步驟(1)所述重組轉(zhuǎn)移載體左、右臂基因序列中插入篩選表達(dá)盒基因片段，獲得同源重組轉(zhuǎn)移載體；
14、(3)將步驟(2)所述同源重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染至感染了親本非洲豬瘟毒株的bmdm細(xì)胞，純化篩選獲得r298l基因編碼蛋白功能喪失的減毒非洲豬瘟病毒株。
15、本專利技術(shù)的有益效果是：本專利技術(shù)通過喪失ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018的r298l基因編碼蛋白的功能，獲得了一種減毒非洲豬瘟病毒株，所述的減毒非洲豬瘟病毒株毒力顯著致弱，具有良好的安全性能。通過在親本毒株(ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018)中喪失r298l基因編碼蛋白的功能，進(jìn)而降低了親本毒株的毒性，獲得的減毒非洲豬瘟病毒能對(duì)非洲豬瘟病毒親本毒株的攻擊提供良好的免疫保護(hù)作用，且安全性高，適于作為預(yù)防非洲豬瘟的疫苗候選株。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.通過在II型非洲豬瘟病毒株ASFV?CN/GS2018中缺失R298L基因制備非洲豬瘟減毒株的應(yīng)用，其特征在于，所述II型非洲豬瘟病毒株ASFV?CN/GS2018保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：V202096。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述R298L基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。
3.通過在II型非洲豬瘟病毒株ASFV?CN/GS2018中缺失R298L基因制備非洲豬瘟減毒疫苗的應(yīng)用，其特征在于，所述II型非洲豬瘟病毒株ASFV?CN/GS2018保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：V202096。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述R298L基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。
5.一種基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株，其特征在于，所述基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株為R298L基因缺失的II型非洲豬瘟病毒株ASFV?CN/GS2018，所述II型非洲豬瘟病毒株ASFV?CN/GS2018保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：V202
6.如權(quán)利要求5所述的減毒非洲豬瘟病毒株，其特征在于，所述R298L基因編碼蛋白的序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述R298L基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。
7.如權(quán)利要求5或6所述的基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株在制備非洲豬瘟疫苗中的應(yīng)用。
8.一種非洲豬瘟減毒疫苗，其特征在于，所述非洲豬瘟減毒疫苗包括權(quán)利要求5或6所述的基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株。
9.如權(quán)利要求5或6所述減毒非洲豬瘟病毒株的制備方法，其特征在于，所述方法為：通過基因工程手段將親本非洲豬瘟病毒株R298L基因的全部或部分核苷酸序列缺失使R298L基因編碼蛋白的功能喪失。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法為同源重組技術(shù)，所述方法包括以下步驟：
...【技術(shù)特征摘要】
1.通過在ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018中缺失r298l基因制備非洲豬瘟減毒株的應(yīng)用，其特征在于，所述ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no：v202096。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述r298l基因序列如seq?id?no.1所示。
3.通過在ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018中缺失r298l基因制備非洲豬瘟減毒疫苗的應(yīng)用，其特征在于，所述ii型非洲豬瘟病毒株asfv?cn/gs2018保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctcc?no：v202096。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述r298l基因序列如seq?id?no.1所示。
5.一種基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株，其特征在于，所述基因缺失減毒非洲豬瘟病毒株為r298l基因缺失的ii型非洲豬瘟病毒株asfv...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭海學(xué)，李偉偉，范許許，齊曉蘭，朱紫祥，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心蘭州分中心，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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