【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片的制備方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、藥物性肝衰竭(drug-induced?liver?failure，dilf)是由各類處方或非處方的化學(xué)藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥(tcm)、天然藥(nm)、保健品(hp)、膳食補(bǔ)充劑(ds)及其代謝產(chǎn)物乃至輔料等所誘發(fā)的肝損傷進(jìn)展而來的急性肝衰竭(alf)。它是藥物性肝損傷(drug-induced?liver?injury，dili)最嚴(yán)重的臨床類型，預(yù)后較差，病死率高達(dá)24-52％。目前dilf的治療主要有內(nèi)科保守治療、人工肝支持系統(tǒng)、粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)治療、體內(nèi)肝細(xì)胞移植以及肝移植等方法，肝移植是目前治療dilf最為有效的辦法，但供肝短缺、免疫反應(yīng)、費(fèi)用昂貴等客觀存在的因素，使得其無法滿足臨床治療需求，限制了其臨床應(yīng)用推廣。
2、細(xì)胞治療作為新興的治療選擇，在減緩炎癥、改善瘢痕化，替代組織器官功能以及促進(jìn)組織器官再生修復(fù)等方面具有明顯優(yōu)勢，是各類難治病極具潛力的治療手段，而人胚胎干細(xì)胞(human?embryonic?stem?cells，hescs)因?yàn)槠涠嘞蚍只臐撃艿忍匦裕徽J(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最佳候選細(xì)胞之一，由hescs定向誘導(dǎo)分化而來的功能細(xì)胞更是有望成為肝衰竭等終末期肝病的治療新策略。在細(xì)胞治療中，細(xì)胞的遞送是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，目前在細(xì)胞治療中應(yīng)用的細(xì)胞傳遞方式有細(xì)胞懸液、生物可降解支架、類器官、細(xì)胞片工程技術(shù)這幾類。其中，應(yīng)用最為廣泛的是懸液注射，但懸液治療無胞間相互作用，不利于細(xì)胞的生存、相
3、但目前，暫未有細(xì)胞片技術(shù)與胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化技術(shù)的結(jié)合以及在肝臟疾病中的應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于此，本申請一實(shí)施例提供一種人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片的制備方法及其應(yīng)用。
2、本申請一方面提供一種人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片的制備方法，包括：提供人胚胎干細(xì)胞，將所述人胚胎干細(xì)胞向限定性內(nèi)胚層誘導(dǎo)分化，收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞；
3、再將所述誘導(dǎo)后的細(xì)胞向肝系細(xì)胞定向分化；以及，
4、培養(yǎng)所述定向分化后的細(xì)胞至成熟，利用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)容器制備人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片。
5、在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述人胚胎干細(xì)胞向限定性內(nèi)胚層誘導(dǎo)分化包括：
6、將所述人胚胎干細(xì)胞先于第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2天，再于第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～4天；
7、所述第一培養(yǎng)基包含rpmi-1640培養(yǎng)基、人活化素a和wnt3a；
8、所述第二培養(yǎng)基包含rpmi-1640培養(yǎng)基、人活化素a和胎牛血清。
9、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第一培養(yǎng)基包含rpmi-1640培養(yǎng)基、終濃度為5ng/ml～300ng/ml的人活化素a和終濃度為20ng/ml～100ng/ml的wnt3a；和或，
10、所述第二培養(yǎng)基包含rpmi-1640培養(yǎng)基、終濃度為10ng/ml～200ng/ml的人活化素a和終濃度為0.2％～2％的胎牛血清。
11、在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述誘導(dǎo)后的細(xì)胞向肝系細(xì)胞定向分化包括：
12、將所述誘導(dǎo)后的細(xì)胞先于第三培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天～12天，再于第四培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天～12天；
13、所述第三培養(yǎng)基包含ko/dmem培養(yǎng)基、以及角質(zhì)細(xì)胞生長因子和胎牛血清；
14、所述第四培養(yǎng)基包含ko/dmem培養(yǎng)基、以及血清替代物(sr)、l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇和二甲基亞砜。
15、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第三培養(yǎng)基包含ko/dmem培養(yǎng)基、以及終濃度為15ng/ml～100ng/ml的角質(zhì)細(xì)胞生長因子和終濃度為2％～3％胎牛血清；
16、所述第四培養(yǎng)基包含ko/dmem培養(yǎng)基、以及終濃度為18％～22％血清替代物(sr)、終濃度為1mm～3mm的l-谷氨酰胺、終濃度為0.1％～15％的非必需氨基酸、終濃度為0.1mm～0.12mm的β-巰基乙醇和終濃度為0.2％～2％的二甲基亞砜。
17、在其中一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)所述定向分化后的細(xì)胞至成熟包括于第五培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天；
18、所述第五培養(yǎng)基包含l-15培養(yǎng)基以及牛血清、肝細(xì)胞生長因子、抑瘤素、地塞米松和l-谷氨酰胺；
19、可選地，所述第五培養(yǎng)基包含l-15培養(yǎng)基以及終濃度為8％～12％胎牛血清、終濃度為10ng/ml～300ng/ml肝細(xì)胞生長因子、終濃度為5ng/ml～150ng/ml的抑瘤素、0.05μm～1.2μm的地塞米松和終濃度為2mm～3mm的l-谷氨酰胺。
20、在其中一個(gè)實(shí)施例中，利用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)容器制備人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片包括：
21、將培養(yǎng)成熟的人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞消化成單細(xì)胞，接種于溫度反應(yīng)性培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)3～4天，待所述溫度反應(yīng)性培養(yǎng)容器中人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞建立連結(jié)后，細(xì)胞自動(dòng)以細(xì)胞片的形式與所述容器的底分離，制備人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片。
22、在其中一個(gè)實(shí)施例中，每隔22h～26h更換一次培養(yǎng)基；
23、在其中一個(gè)實(shí)施例中，更換培養(yǎng)基時(shí)用rpim-1640清洗1～2遍。
24、本申請另一方面提供所述的人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片的制備方法制備得到的人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片。
25、本申請另一方面還提供所述的人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片的制備方法制備得到的人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片在制備防治肝臟疾病的藥物中的應(yīng)用；
26、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述防治肝臟疾病的藥物防治急性藥物性肝衰竭。
27、本申請的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例細(xì)節(jié)在下面的描述中提出，本申請的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將從說明書及其權(quán)利要求書變得明顯。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片的制備方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將所述人胚胎干細(xì)胞向限定性內(nèi)胚層誘導(dǎo)分化包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述第一培養(yǎng)基包含RPMI-1640培養(yǎng)基、終濃度為5ng/mL～300ng/mL的人活化素A和終濃度為20ng/mL～100ng/mL的Wnt3a；和/或，
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將所述誘導(dǎo)后的細(xì)胞向肝系細(xì)胞定向分化包括：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述第三培養(yǎng)基包含KO/DMEM培養(yǎng)基、以及終濃度為15ng/mL～100ng/mL的角質(zhì)細(xì)胞生長因子和終濃度為2％～3％胎牛血清；
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)所述定向分化后的細(xì)胞至成熟包括于第五培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10天；
7.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，利用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)容器制備人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片包括：
8.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述
9.由權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述的人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片的制備方法制備得到的人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片。
10.由權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述的人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片的制備方法制備得到的人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片在制備防治肝臟疾病的藥物中的應(yīng)用；
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種人胚胎干細(xì)胞來源的肝樣細(xì)胞片的制備方法，其特征在于，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將所述人胚胎干細(xì)胞向限定性內(nèi)胚層誘導(dǎo)分化包括：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述第一培養(yǎng)基包含rpmi-1640培養(yǎng)基、終濃度為5ng/ml～300ng/ml的人活化素a和終濃度為20ng/ml～100ng/ml的wnt3a；和/或，
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將所述誘導(dǎo)后的細(xì)胞向肝系細(xì)胞定向分化包括：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述第三培養(yǎng)基包含ko/dmem培養(yǎng)基、以及終濃度為15ng/ml～100ng/ml的角質(zhì)細(xì)胞生長因子和終濃度為2％～3％...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫懿，林戈，盧光琇，
申請(專利權(quán))人：湖南光琇高新生命科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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