【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分子生物，具體涉及一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的rt-pcr試劑盒及其使用方法。
技術(shù)介紹
1、皰疹病毒感染是一種常見的病毒性疾病，由多種皰疹病毒引起，包括單純皰疹病毒(hsv)、水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)、eb病毒(ebv)等。這些病毒具有高度的傳染性和潛在的致病性，能夠引起從輕微的皮膚病變到嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種臨床表現(xiàn)。皰疹病毒的感染可以分為原發(fā)性感染和潛伏感染。原發(fā)性感染通常發(fā)生在個(gè)體生命的早期，而潛伏感染則是在原發(fā)感染后，病毒在體內(nèi)某些細(xì)胞中保持休眠狀態(tài)，直到機(jī)體免疫力下降或其他觸發(fā)因素出現(xiàn)時(shí)，病毒被重新激活，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染。早期診斷對(duì)于皰疹病毒感染具有重要意義，不僅可以提高治療效果，減少誤診率和并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，還可以提高生活質(zhì)量，促進(jìn)疾病管理，并提高診斷準(zhǔn)確性。
2、人皰疹病毒5型(hhv-5)，也稱為人類巨細(xì)胞病毒(hcmv)，屬于皰疹病毒科的β-皰疹病毒亞科。這種病毒在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，尤其在免疫功能正常的個(gè)體中較為常見。hcmv的感染通常不會(huì)引起癥狀，但在免疫系統(tǒng)受損的個(gè)體中，如艾滋病患者、器官移植受者和接受骨髓移植的患者中，可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病。
3、人皰疹病毒6型(hhv-6)是一種屬于β-皰疹病毒亞科的雙鏈dna病毒，首次從艾滋病患者和淋巴增生異常患者的末梢血中的單核細(xì)胞中分離得到。hhv-6具有顯著的嗜淋巴細(xì)胞性和嗜神經(jīng)性，與多種疾病相關(guān)，包括嬰兒急疹、器官移植后的感染等。
4、人皰疹病毒7型(hhv-7)是一種嗜淋巴病毒，屬于β-皰疹病毒亞科，首次在1
5、人皰疹病毒8型(hhv-8)，也稱為卡波西肉瘤相關(guān)的人類皰疹病毒(kshv)，是一種γ-皰疹病毒，與多種疾病特別是淋巴細(xì)胞相關(guān)的惡性疾病相關(guān)。hhv-8的感染與kaposi肉瘤(ks)、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(pel)、多中心卡斯特爾曼病(mcd)等疾病有關(guān)。
6、目前臨床上人皰疹病毒的檢測方法主要為細(xì)胞培養(yǎng)與血清學(xué)方法。細(xì)胞培養(yǎng)方法存在速度慢、成功率低、成本高、勞動(dòng)強(qiáng)度大等缺點(diǎn)。免疫學(xué)方法為目前主流檢測方法，但檢測靈敏度與特異性還不能滿足臨床需求。基于熒光pcr核酸檢測技術(shù)在時(shí)間、通量、靈敏度與特異性等方面有突出的優(yōu)勢(shì)，越來越受到廣泛的應(yīng)用。本領(lǐng)域中存在對(duì)可以更高效地實(shí)現(xiàn)人皰疹病毒多指標(biāo)同檢的引物及探針的需要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)
技術(shù)介紹
中提到的現(xiàn)有熒光pcr檢測人皰疹病毒技術(shù)中存在的靈敏度不足、特異性較差等問題，為了解決上述問題，本專利技術(shù)公開了一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的rt-pcr試劑盒及其使用方法，通過對(duì)引物和探針進(jìn)行特異性設(shè)計(jì)，提高了檢測的靈敏度和特異性。
2、本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：
3、一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的rt-pcr試劑盒，所述試劑盒為全預(yù)混的試劑，所述試劑盒包含擴(kuò)增用的緩沖溶液、taq酶和用于檢測的引物探針，所述試劑盒檢測的人皰疹病毒包括人皰疹病毒5型、人皰疹病毒6型、人皰疹病毒7型和人皰疹病毒8型。
4、進(jìn)一步，所述引物包括：用于檢測人皰疹病毒5型的正向引物：
5、5’-ggccgttactgtctgcagga-3’，如seq?id?no.1所示，反向擴(kuò)增引物：5’-ggcctcgtagtgaaaattaatggt-3’，如seq?id?no.2所示；
6、用于檢測人皰疹病毒6型的正向引物：
7、5’-aaagacctaaattgccgctacct-3’，如seq?id?no.3所示，
8、反向擴(kuò)增引物：5’-gcaagctcatgaacatcgtca-3’，如seq?id?no.4所示；
9、用于檢測人皰疹病毒7型的正向引物：
10、5’-ccaatccttccgaaaccgat-3’，如seq?id?no.5所示，
11、反向擴(kuò)增引物：5’-cggaagtcactggagtaatgacaa-3’，如seq?id?no.6所示；
12、用于檢測人皰疹病毒8型的正向引物：
13、5’-ctgcgacatatttccctgatcc-3’，如seq?id?no.7所示，
14、反向擴(kuò)增引物：5’-tggatcatgactacgctcaccat-3’，如seq?id?no.8所示。
15、進(jìn)一步，所述探針包括：用于人皰疹病毒5型的探針：
16、5’-ccgtattggtgcgcgatctgttcaa-3’，如seq?id?no.9所示；
17、用于人皰疹病毒6型的探針：
18、5’-ttagatggtggtgagctgggatcggt-3’，如seq?id?no.10所示；
19、用于人皰疹病毒7型的探針：5’-ctcgcagattgcttgttggccatg-3’，如seq?id?no.11所示；5’-tcggtaagataaataagcaatca-3’，如seq?id?no.12所示；
20、用于人皰疹病毒8型探針：5’-ttcatgcgagccaccag-3’，如seq?id?no.13所示。
21、進(jìn)一步，所述人皰疹病毒5型的檢測探針序列5’端標(biāo)記有fam熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)mgb；
22、所述人皰疹病毒6型的檢測探針序列5’端標(biāo)記有vic熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)mgb；
23、所述人皰疹病毒7型的檢測探針序列5’端標(biāo)記有cy5熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq2；
24、所述人皰疹病毒8型的檢測探針序列5’端標(biāo)記有rox熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)bhq2。
25、進(jìn)一步，所述引物序列中堿基“a+”、“c+”和“g+”為鎖核酸修飾的堿基。
26、進(jìn)一步，所述試劑中引物終濃度為444nm，探針終濃度為222nm。
27、本專利技術(shù)還提供了一種同時(shí)檢測人皰疹病毒5、6、7、8型核酸多重快速rt-pcr方法，具體步驟包括：
28、步驟一：提取樣本核酸；
29、步驟二：將試劑解凍混勻后直接進(jìn)行分裝至96孔板或八連管，將提取的樣本模版、陰性對(duì)照、陽性質(zhì)控品分別加入到不同的pcr反應(yīng)管種，蓋好管蓋，放置到熒光定量pcr儀種進(jìn)行熒光pcr檢測。
30、步驟三：待步驟二反應(yīng)完成后，設(shè)置自動(dòng)調(diào)整基線，根據(jù)擴(kuò)增曲線圖和ct值對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行分析。
31、進(jìn)一步，所述反應(yīng)條件為預(yù)變性階段95℃，2min；擴(kuò)增階段95℃，5s、56℃，30s，循環(huán)40次。
32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)：
<本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為全預(yù)混的試劑，所述試劑盒包含擴(kuò)增用的緩沖溶液、taq酶和用于檢測的引物探針，所述試劑盒檢測的人皰疹病毒包括人皰疹病毒5型、人皰疹病毒6型、人皰疹病毒7型和人皰疹病毒8型。
2.如權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述引物包括
3.如權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的RT-PCR試劑盒，其特征在于，所述探針包括：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述人皰疹病毒5型檢測探針序列SEQ?ID?No.9中5’端標(biāo)記有FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)MGB；
5.如權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的RT-PCR試劑盒，其特征在于：其特征在于，所述引物序列中的特定部位堿基“A+”、“C+”和“G+”為鎖核酸修飾的堿基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的RT-PCR試劑盒，其特征在于：所述試劑中引物終濃度為?444nM，
7.權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)中所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的RT-PCR試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的RT-PCR試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟二中反應(yīng)條件為預(yù)變性階段95℃，2min；擴(kuò)增階段95℃，5s、56℃，30s，循環(huán)40次。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的rt-pcr試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為全預(yù)混的試劑，所述試劑盒包含擴(kuò)增用的緩沖溶液、taq酶和用于檢測的引物探針，所述試劑盒檢測的人皰疹病毒包括人皰疹病毒5型、人皰疹病毒6型、人皰疹病毒7型和人皰疹病毒8型。
2.如權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的rt-pcr試劑盒，其特征在于，所述引物包括
3.如權(quán)利要求2所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的rt-pcr試劑盒，其特征在于，所述探針包括：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種同時(shí)檢測多種人皰疹病毒的rt-pcr試劑盒，其特征在于：所述人皰疹病毒5型檢測探針序列seq?id?no.9中5’端標(biāo)記有fam熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)mgb；
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：丁小靜，張倩，楊揚(yáng)，戴舒雅，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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