【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于化學工程及酶工程領域，具體地涉及一種n-脫氧核糖轉移酶突變體及其用于合成n6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷。
技術介紹
1、核苷類似物作為一類重要的抗癌治療劑和特異性抗病毒藥物，包括各種嘌呤和嘧啶核苷的衍生物，主要是一類抗代謝物，以破壞病毒轉錄、干擾或終止病毒核酸的合成為目的。目前使用的抗病毒藥物中近50％是核苷類藥物，如用于治療皰疹病毒感染的阿昔洛韋、泛昔洛韋，治療單純皰疹及腦炎的阿糖腺苷，治療丙型肝炎的利巴韋林、索非布韋，治療艾滋病的hiv逆轉錄酶抑制劑齊多夫定、扎西他濱、司他夫定、拉米夫定，以及新一代抗腫瘤藥物地西他濱、吉西他濱、奈拉濱等都屬于核苷類藥物。
2、n6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷，作為核苷類似物的一種，具有抗病毒以及抗腫瘤活性，能夠有效地嵌入病毒的dna鏈以及rna鏈中，從而抑制細胞的分裂和復制，因此在國內外醫藥市場和臨床治療的需求也在穩步上升。n6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷一般采用化學合成法和酶法，化學合成法是一個多步驟過程，為了實現區域和立體選擇性，需要進行保護與脫保護基團的過程，操作步驟復雜，成本高昂，容易產生有毒有害物質，對環境造成污染。酶法合成由于其高度的區域選擇性以及立體選擇性越來越受到人們的重視。酶法合成能夠在溫和的反應條件下進行，催化效率高，綠色環保無污染，可以有效的減少后處理過程中純化等步驟。
3、n-脫氧核糖轉移酶(ec.2.4.2.6)可以催化脫氧核糖在不同堿基之間的轉移，根據底物特異性的不同可以分為兩類：n-脫氧核糖轉移酶ⅰ
4、ndt堿基識別范圍廣，可以識別多種天然和經過修飾的堿基，且轉化率較高，因此被應用于多種脫氧核苷類似物的合成，如5-氟-2'-脫氧尿苷，6-氯-2'-脫氧胞苷等。但ndt對核糖供體的結構有高度底物特異性，對于帶有糖基修飾的核苷類似物，如阿糖胞苷、司他夫定、吉西他濱和扎西他濱等，催化合成的效率極低，限制了ndt的應用。因此需要通過對野生型ndt定向進化改造，擴大ndt的底物識別范圍，提高酶的活性。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種n-脫氧核糖轉移酶突變體及其在n6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷合成中的應用。
2、為了克服化學合成法的缺陷，本專利技術公開了一種進化改造的n-脫氧核糖轉移酶以及合成n6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷的方法，以2’-氟-2’-脫氧類核糖供體和n6-苯甲酰基腺嘌呤為原料，采用一鍋法得到n6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷。本專利技術的實施例的合成工藝操作簡單、安全，成本低廉，污染少，易于實現工業化。
3、本專利技術的第一方面，提供了一種n-脫氧核糖轉移酶，與seq?id?no：1所示的氨基酸序列相比，所述n-脫氧核糖轉移酶氨基酸序列在第67位、第88位和第91位中的任意一個位置、任意兩個或全部三個位置上具有取代突變。
4、在一個或多個實施方案中，所述第67位上的突變為野生型的絲氨酸被突變成極性不帶電荷，如蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺；
5、所述第88位上的突變為野生型的亮氨酸被突變成極性帶正電荷的氨基酸，如賴氨酸、精氨酸或組氨酸；或被突變成非極性氨基酸，如丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸或甘氨酸；或被突變成極性帶負電荷的氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸；
6、所述第91位上的突變為野生型的谷氨酸被突變成非極性氨基酸，如丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸或甘氨酸；或被突變成極性不帶電荷，如絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
7、在一個或多個實施方案中，所述第67位上的突變為野生型的絲氨酸被突變成蘇氨酸或半胱氨酸；
8、所述第88位上的突變為野生型的亮氨酸被突變成賴氨酸、精氨酸或組氨酸；或被突變成丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸；或被突變成天冬氨酸或谷氨酸；
9、所述第91位上的突變為野生型的谷氨酸被突變成丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸；或被突變成極性不帶電荷，如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。
10、在一個或多個實施方案中，與seq?id?no：1相比，所述n-脫氧核糖轉移酶的突變選自：
11、(1)s67t，
12、(2)l88v、l88i、l88e或l88r，和
13、(3)e91a、e91s、e91f或e91y。
14、在一個或多個實施方案中，與seq?id?no：1相比，所述n-脫氧核糖轉移酶的突變為l88v、l88i、e91a、e91s、e91f或e91y。
15、本專利技術的第二方面，提供了一種多核苷酸分子，其多核苷酸序列選自：
16、(1)編碼本專利技術第一方面所述的n-脫氧核糖轉移酶的多核苷酸序列；和
17、(2)(1)所述多核苷酸序列的互補序列。
18、本專利技術的第三方面，提供了一種核酸構建物，其含有本專利技術第二方面所述的多核苷酸分子；優選地，所述核酸構建物為表達盒。
19、本專利技術的第四方面，提供了一種載體，其含有本專利技術第二方面所述的多核苷酸分子或本專利技術第三方面所述的核酸構建物；優選地，所述載體為克隆載體或表達載體。
20、本專利技術的第五方面，提供了一種宿主細胞，其：(1)表達權利要求1-5中任一項所述的n-脫氧核糖轉移酶，和/或(2)含有本專利技術第二方面所述的多核苷酸分子、本專利技術第三方面所述的核酸構建物或本專利技術第四方面所述的載體；優選地，所述宿主細胞為大腸桿菌。
21、本專利技術的第六方面，提供了一種酶制劑，其含有本專利技術第一方面所述的n-脫氧核糖轉移酶.
22、在一個或多個實施方案中，所述酶制劑還含有緩沖液；優選地，所述緩沖液為tris-hcl緩沖液；優選地，所述緩沖液的ph為5～10，優選為6～9，更優選為7～8.
23、在一個或多個實施方案中，所述酶制劑為粉末，如凍干粉末。
24、在一個或多個實施方案中，所述酶制劑是所述表達n-脫氧核糖轉移酶的宿主細胞裂解后獲得的上清液，或為該上清液的濃縮液。
25、本專利技術的第七方面，提供了一種本專利技術第一方面所述的n-脫氧核糖轉移酶在催化轉移2’-氟-2’脫氧核糖基團中的應用，或在制備n6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷中的應用，或在制備用于制備n6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷的酶制劑中的應用。
26、本專利技術的第八方面，提供了一種n6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷的制備方法，所述方法包括：
27、
28、使用本專利技術第一方面所述的n-脫氧核糖轉移酶催化n6-苯甲酰基本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種N-脫氧核糖轉移酶，與SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列相比，所述N-脫氧核糖轉移酶氨基酸序列在第67位、第88位和第91位中的任意一個位置、任意兩個或全部三個位置上具有取代突變。
2.如權利要求1所述的N-脫氧核糖轉移酶，其特征在于：
3.如權利要求2所述的N-脫氧核糖轉移酶，其特征在于：
4.如權利要求1所述的N-脫氧核糖轉移酶，其特征在于，與SEQ?ID?NO：1相比，所述N-脫氧核糖轉移酶的突變選自：
5.如權利要求1所述的N-脫氧核糖轉移酶，其特征在于，與SEQ?ID?NO：1相比，所述N-脫氧核糖轉移酶的突變為L88V、L88I、E91A、E91S、E91F或E91Y。
6.一種多核苷酸分子，其多核苷酸序列選自：
7.一種核酸構建物，其含有權利要求6所述的多核苷酸分子；優選地，所述核酸構建物為表達盒。
8.一種載體，其含有權利要求6所述的多核苷酸分子或權利要求7所述的核酸構建物；優選地，所述載體為克隆載體或表達載體。
9.一種宿主細胞，其：(1)表達權利要求1-
10.一種酶制劑，其含有權利要求1-5中任一項所述的N-脫氧核糖轉移酶；
11.權利要求1-5中任一項所述的N-脫氧核糖轉移酶在催化轉移2’-氟-2’脫氧核糖基團中的應用，或在制備N6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷中的應用，或在制備用于制備N6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷的酶制劑中的應用。
12.N6-苯甲酰基-2'-氟-2'-脫氧腺苷的制備方法，其特征在于，所述方法包括：
13.如權利要求12所述的制備方法，其特征在于，所述方法具有以下一項或多項特征：
...【技術特征摘要】
1.一種n-脫氧核糖轉移酶，與seq?id?no：1所示的氨基酸序列相比，所述n-脫氧核糖轉移酶氨基酸序列在第67位、第88位和第91位中的任意一個位置、任意兩個或全部三個位置上具有取代突變。
2.如權利要求1所述的n-脫氧核糖轉移酶，其特征在于：
3.如權利要求2所述的n-脫氧核糖轉移酶，其特征在于：
4.如權利要求1所述的n-脫氧核糖轉移酶，其特征在于，與seq?id?no：1相比，所述n-脫氧核糖轉移酶的突變選自：
5.如權利要求1所述的n-脫氧核糖轉移酶，其特征在于，與seq?id?no：1相比，所述n-脫氧核糖轉移酶的突變為l88v、l88i、e91a、e91s、e91f或e91y。
6.一種多核苷酸分子，其多核苷酸序列選自：
7.一種核酸構建物，其含有權利要求6所述的多核苷酸分子；優選地，所述核酸構建物為表達盒。
8.一種載體，其含有...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張波琨，李杰，黃月園，卞琪，張藝，
申請(專利權)人：上海合全藥物研發有限公司，
類型：發明
國別省市：
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