【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及核酸檢測，更具體地說是一種結合微流控技術、過渡態分子結構制備和crispr/cas12a技術來完成降低dna芯片上熒光背景的方法。
技術介紹
1、微流控芯片有高通量、便攜性、低試劑消耗等特點，可以被集成為獨立的“芯片實驗室”系統。它們相比傳統的宏觀系統具有幾個優勢，包括減少樣品和試劑體積，更快的分析時間，以及將多種功能集成到單個芯片上的能力。對于一般的dna芯片，捕獲探針是將信號分子固定在芯片上的工具，其面臨的一個挑戰是信號探針的非特異性吸附，這種非特異性吸附通常是由于少量dna的3'端羥基與芯片表面的醛基縮合而引起的，此外對dna的非特異性識別也會導致強背景信號。
2、crispr-cas系統利用crrna精確地引導cas蛋白識別和切割目標核酸，從而引發對單鏈dna的不加區分的切割。利用這一機制，研究人員能夠區分單鏈和雙鏈dna分子，并通過激活cas12a反式切割活性產生不同的信號進行核酸定量。然而，在更復雜的樣品中，crrna和dna的非特異性結合和識別可能會產生假陽性信號。已經有許多研究使用cas12a反式切割來獲得更低的背景，但它們可能具有更復雜的核酸設計，更繁瑣的程序和更長的反應時間，這會使分析復雜化。因此，希望開發的方法可以減少芯片上非特異性吸附，并且具有簡單可編程的核酸設計來減少crrna的非特異性識別。
3、在本專利技術中，我們開發了一種基于過渡態分子開關的crispr介導的dna芯片熒光檢測，用于降低芯片上的背景熒光。過渡態分子開關的引入提供了簡單可編程的核酸設計以進行核酸
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是降低微流控上核酸檢測的熒光背景。
2、一種基于過渡態分子開關的crispr系統降低dna芯片背景熒光的方法，其特征是包括以下步驟：
3、(1)玻璃基底的處理
4、使用25×75mm2載玻片作為玻璃基底。分別使用環己烷、無水乙醇、超純水超聲清洗掉表面雜質。清洗后浸泡在1m?naoh溶液中60℃加熱2h進行羥基化處理，使用去離子水超聲10min并洗凈。隨后放入體積比為無水乙醇：去離子水：aptes＝95:3:2的混合溶液中浸泡2h以完成硅烷化處理。使用無水乙醇和大量去離子水沖洗，氮氣吹干后60℃真空干燥1h。最后將硅烷化之后的玻璃基底放入2.5％的戊二醛溶液中(1×pbs溶液稀釋)浸泡2h。大量去離子水沖洗干凈，氮氣吹干后60℃真空干燥30min。處理完的玻璃基底放入充氮氣的盒子中4℃保存。
5、(2)流道打印芯片的制備
6、流道打印芯片在有流道的硅片模具上制備，選用的材料是聚二甲基硅氧烷(pdms)，尺寸為25×75mm2。將pdms與促凝劑按照10:1的比例混合，攪拌均勻置于真空環境20分鐘去除氣泡。然后倒入硅板模具上，于80℃下加熱2h使流道打印芯片完全固化。最后將固化好的pdms揭下，在流道兩端添加直徑1mm的進樣孔與出樣孔。
7、(3)樣品加載芯片的制備
8、樣品加載芯片尺寸為25×75mm2。樣品加載芯片是通過激光刻蝕制備的。將絕緣橡膠通過光刻蝕刻出設計好的樣品加載池。每一個樣品加載芯片有11個樣品加載池，可以獨立進行11個不同的反應。樣品加載池與打印在玻璃基板上的流道相互垂直，反應結束后于兩者交叉處觀察到信號。
9、(4)捕獲探針的修飾
10、將流道打印芯片與玻璃基底緊密貼合，確保捕獲探針按照流道的形狀修飾在玻璃基底上。每個進樣孔分別注入1.5μl的捕獲探針溶液(10μm)，用泵在出樣孔抽吸，使其充滿整條流道。待所有流道都充滿捕獲探針溶液，將進樣孔與出樣孔封住，以免捕獲探針溶液蒸發。將其放入濕盒37℃保持過夜。揭下流道打印芯片后將玻璃基底放入真空干燥箱60℃保持1h，使用0.2％?sds溶液和去離子水分別洗滌三次，氮氣吹干。使用2％?bsa/pbs溶液對過量戊二醛進行封閉1h。然后用pbs溶液和去離子水分別洗滌3次，氮氣吹干后進行后續實驗。(5)過渡態分子開關的合成與預混合液的制備
11、將100μm的s1和s2混合在te反應緩沖液(ph＝8.5)中。95℃下孵育10min,0.1℃/s緩慢冷卻至25℃后靜置30min。取1μl然后加入19μl?taq聚合酶和10×buffer完成分子開關，室溫孵育3h后加入5μl?dntps，使用te緩沖液稀釋至50ml備用作為預混合液a。使用含1μm?cas12a與1.2μm?crrna的溶液作為預混液b。
12、(5)樣本的處理與檢測
13、取2μl預混合液a，加入2μl待測樣品，注入反應池，60℃反應20min后加入3μl預混液b，置于37℃反應1h，sds溶液和大量水沖洗后干燥，放入熒光陣列掃描儀讀取熒光。
14、本專利技術的有益效果
15、(1)構建了基于過渡態分子開關和crispr技術用于降低微流控芯片上熒光背景的方法。
16、(2)使用過渡態分子開關進行crispr技術識別核酸的預篩選，為檢測方法提供了更好的特異性。
17、(3)過渡態分子開關和crispr技術的結合，可以在生成信號分子的同時降低熒光背景，簡化了操作步驟和核酸設計。
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1.一種基于過渡態分子開關的CRISPR系統降低DNA芯片背景熒光的方法，其特征是包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種基于過渡態分子開關的CRISPR系統降低DNA芯片背景熒光的方法，其特征在于，使用過渡態分子開關對CRISPR系統識別的核酸進行預篩選，生成目標物-S1序列并被Cas12a識別后激發其反式切割活性。
3.根據權利要求1所述一種基于過渡態分子開關的CRISPR系統降低DNA芯片背景熒光的方法，其特征在于，過渡態分子開關在目標物存在的情況下使Taq聚合酶恢復活性，在60℃發生鏈延伸，從而保護探針上的信號分子。
【技術特征摘要】
1.一種基于過渡態分子開關的crispr系統降低dna芯片背景熒光的方法，其特征是包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種基于過渡態分子開關的crispr系統降低dna芯片背景熒光的方法，其特征在于，使用過渡態分子開關對crispr系統識別的核酸進行預篩選，生成目...
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