【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程，具體涉及一種高產赤霉素ga3的基因工程菌的構建方法，構建得到的基因工程菌，以及該基因工程菌在生產赤霉素ga3中的應用。
技術介紹
1、赤霉素(gibberellinacid，ga3)是由植物、部分真菌合成的一種由四環骨架衍生而得的二萜類酸重要植物激素，分子式c19h22o6，分子量346.37，熔點233～235℃，易溶于醇類、丙酮、乙酸乙酯、碳酸氫鈉溶液以及ph為6.2的磷酸緩沖液，難溶于水和乙醚。藤倉赤霉菌中ga3的合成場所在細胞質，其生物合成由tca循環合成的乙酰輔酶a(acetyl-coa)出發，經甲羥戊酸(mva)合成異戊烯焦磷酸(ipp)及其異構體二甲烯丙基二磷酸(dmapp)，后續由合成酶催化經由香葉基焦磷酸(gpp)，法尼基焦磷酸(fpp)合成前體二基焦磷酸(ggpp)。在赤霉素合成基因簇的作用下，兩分子ggpp環化合成焦磷酸古巴酯(cpp)后，產生了貝殼杉烯。在c-19上由p450單加氧酶逐步氧化產生貝殼杉烯酸，后續通過在c-7α與c-6β位置的氧化產生ga12-半醛，p450單加氧酶在c-3β與c-7的氧化下產生ga14，ga14通過氧化轉化為ga4，經去飽和作用生產ga7，經羥基化轉化為ga3。早在20世紀30年代，科學家就在藤倉赤霉菌的次生代謝物中發現赤霉素，赤霉素是最重要的植物生長調節劑之一，在農業生產中得到越來越廣泛的應用，具有廣闊的市場前景，但其工業化的高生產成本嚴重制約著它的廣泛應用。ga3作為一種次級代謝產物，一般通過液態發酵、固態發酵與植物提取的方式獲得。目前ga3的生
2、微生物發酵法合成萜類化合物具有周期短的顯著特征，既具有綠色天然屬性、又具有經濟性和環境友好性，是具有顯著競爭優勢的生產途徑。但野生型微生物細胞中萜類化合物通常為代謝的中間產物，因此細胞中含量普遍較低，需要通過生物技術改造顯著提高細胞合成效率。
技術實現思路
1、為了解決現有技術中微生物發酵法生產赤霉素ga3合成效率低的問題，本專利技術通過代謝工程技術，提供一種高產赤霉素ga3的基因工程菌的構建方法，該方法利用內質網擴增以提高藤倉赤霉菌赤霉素ga3的產量。經過改造后性能最優的基因工程菌菌株在發酵產赤霉素ga3的水平相比于出發菌株提升了31.5％，顯著提升赤霉素ga3的生產能力，為高產ga3工程菌株的構建提供了可行的路線。
2、本專利技術采用的技術方案是：一種高產赤霉素ga3的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述方法包括：運用crispr-cas9基因編輯技術，在底盤菌基因組中：敲除轉錄抑制因子opi1，和/或敲除磷脂酸磷酸酶編碼基因pah1，和/或增強表達磷脂合成調控因子ino2，構建得到高產赤霉素ga3的基因工程菌。
3、ga3的生物合成途徑是一個多種酶參與的復雜過程，通過mva途徑形成的fpp被認為是ga3等萜類化合物的常見前體。從fpp到ga3的轉化由四種細胞色素p450酶(p450s)依次催化ga3的形成。因此對途徑中關鍵酶及酶基因的研究是實現ga3定向調控必不可少的。作為膜結合蛋白，考慮p450酶在異源底盤中的實際區室也非常重要，這將顯著影響相關蛋白的表達和隨之而來的催化能力。大多數p450天然位于內質網(er)，作為蛋白質折疊的活性位點，er提供了一個微環境，為蛋白質的高效和準確生產進行了優化，er體積空間是蛋白質折疊能力的關鍵決定因素，因此er擴增的菌株提供一種合成底盤，可以在其上實施新的生物合成途徑，以構建用于合成萜烯、生物堿、聚酮和其他具有工業價值的產品的生產平臺菌株。
4、基于以上思路，本專利技術通過增強表達藤倉赤霉菌中關鍵的磷脂合成調控因子ino2，并采用crispr-cas9基因編輯技術敲除轉錄抑制因子opi1以及編碼磷脂酸磷酸酶的pah1基因(圖1)，刺激內質網膜面積擴增，增強了內質網蛋白的合成和折疊能力，并緩解了酶豐度有限的代謝限制，進而提高了ga3的產量，經以上改造策略，成功獲得了高產赤霉素ga3的重組藤倉赤霉菌基因工程菌。其中，轉錄抑制因子opi1調節參與ino2等磷脂合成基因的表達，這些基因響應于內質網中磷脂前體磷脂酸的豐度，因此敲除opi1有利于磷脂合成的增加。而編碼磷脂酸磷酸酶的pah1會導致內質網er的急劇擴張，從而刺激萜類化學物合成酶的產生，并最終促進萜類化合物積累，因此敲除pah1有利于ga3產量的提升。
5、作為優選，增強表達磷脂合成調控因子ino2的方法包括：將tef1啟動子和tef1終止子連接至磷脂合成調控因子ino2的編碼基因，構建ino2基因表達框；將ino2基因表達框替換掉底盤菌基因組中原有基因bik4。
6、作為優選，所述tef1啟動子來源于構巢曲霉，其核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
7、作為優選，所述tef1終止子來源于構巢曲霉，其核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
8、作為優選，所述磷脂合成調控因子ino2的編碼基因序列如seq?id?no.1所示。
9、作為優選，所述底盤菌為藤倉赤霉菌fusariumfujikuroi?cctcc?no:m?2019378，已在中國專利技術專利cn110527630a中公開。
10、作為優選，所述方法包括如下步驟：
11、(1)運用crispr-cas9基因編輯技術，敲除藤倉赤霉菌fusariumfujikuroi?cctccno:m2019378基因組中的opi1基因，構建得到opi1缺陷型菌株ga-1；
12、(2)運用crispr-cas9基因編輯技術，敲除步驟(1)中ga-1基因組中的pah1基因，構建得到pah1營養缺陷型菌株ga-2；
13、(3)將tef1啟動子和tef1終止子連接至磷脂合成調控因子ino2的編碼基因，構建ino2基因表達框，將ino2基因表達框替換掉步驟(2)中ga-2基因組中原有基因bik4，得到過表達ino2的基因工程菌fusariumfujikuroi?cctcc?no:m?2019378，δbik4::ino2δopi1δpah1，記為ga-3，該菌株即所述高產赤霉素ga3的基因工程菌。
14、本專利技術還提供了所述的方法構建得到的高產赤霉素ga3的基因工程菌。經過上述方法改造后的重組藤倉赤霉菌相比于野生型擴增了內質網膜面積，從而刺激重組萜類生物合成酶在內質網中的富集，并最終提高ga3的積累。
15、作為優選，所述基因工程菌為fusariumfujikuroi?cctcc?no:m?2019378，δbik4::ino2δopi1δpah1。作為改造后性能最優的菌株，fusariumfujikuroi?cctcc?no:m2019378，δbik4::ino2δopi1δpah1在發酵產赤霉素ga3的水平相比于底盤菌提升了31.5％，顯著提升赤霉素ga3生產能力，為高產ga3工程菌株的構建提本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高產赤霉素GA3的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述方法包括：運用CRISPR-Cas9基因編輯技術，在底盤菌基因組中：敲除轉錄抑制因子opi1，和/或敲除磷脂酸磷酸酶編碼基因pah1，和/或增強表達磷脂合成調控因子ino2，構建得到高產赤霉素GA3的基因工程菌。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，增強表達磷脂合成調控因子ino2的方法包括：將tef1啟動子和tef1終止子連接至磷脂合成調控因子ino2的編碼基因，構建ino2基因表達框；將ino2基因表達框替換掉底盤菌基因組中原有基因bik4。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂合成調控因子ino2的編碼基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。
5.如權利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述底盤菌為藤倉赤霉菌Fusariumfujikuroi?CCTCC?NO:M?2019378。
6.如權利要求1～5任一所述的方法構建得到的高產赤霉素GA3的基因工程菌。
7.如權利要求6所述的基
8.如權利要求6所述的基因工程菌在微生物發酵制備赤霉素GA3中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述應用包括：將所述的基因工程菌接種于發酵培養基中，在25～30℃、200～300rpm條件下進行發酵培養150～200h，獲得含赤霉素GA3的發酵液，發酵液經分離純化獲得所述赤霉素GA3。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述發酵培養基包括：玉米淀粉70～90g/L，米粉70～90g/L，大豆粉10～30g/L，花生粉10～30g/L，硫酸鉀0.5～1.5g/L，磷酸二氫鉀0.5～1.5g/L，溶劑為水，pH自然。
...【技術特征摘要】
1.一種高產赤霉素ga3的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述方法包括：運用crispr-cas9基因編輯技術，在底盤菌基因組中：敲除轉錄抑制因子opi1，和/或敲除磷脂酸磷酸酶編碼基因pah1，和/或增強表達磷脂合成調控因子ino2，構建得到高產赤霉素ga3的基因工程菌。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，增強表達磷脂合成調控因子ino2的方法包括：將tef1啟動子和tef1終止子連接至磷脂合成調控因子ino2的編碼基因，構建ino2基因表達框；將ino2基因表達框替換掉底盤菌基因組中原有基因bik4。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂合成調控因子ino2的編碼基因序列如seq?id?no.1所示。
5.如權利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述底盤菌為藤倉赤霉菌fusariumfujikuroi?cctcc?no:m?2019378...
【專利技術屬性】
技術研發人員：柳志強，年璐，黃良剛，張博，鄭裕國，
申請(專利權)人：浙江工業大學，
類型：發明
國別省市：
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