【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程領域，特別涉及一種基于功能化gelma水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統。
技術介紹
1、干細胞是組織修復再生中最常見的一類細胞，具有自我更新、多向分化和調節免疫系統的能力，其可以直接從多種成熟器官中分離獲得，如骨髓、脂肪組織和血液等，是組織工程中非常有應用前景的一類細胞。其中，骨髓來源的間充質干細胞可在體內或體外特定的誘導條件下分化為多種組織細胞，其來源廣泛，易于分離培養，并且具有較強的分化潛能和可自體移植等優點，是較理想的細胞來源，用于再生醫學，尤其是關節軟骨修復。
2、細胞微環境與間充質干細胞(mscs)的命運密切相關，骨組織因為其天然的壓電特性使得骨髓間充質干細胞天然就暴露于內源性的電微環境中，已經證明其對細胞生長、存活、分化和形態變化至關重要。然而大多數關于電刺激影響骨髓間充質干細胞分化的研究都是在2d材料表面進行的，二維培養條件不能真實的再現自然微環境的三維結構，細胞在2d培養條件下失去了體內環境中細胞與細胞及細胞與ecm地相互作用，表現出不同地功能和形態特征，以2d培養細胞為基礎地藥物篩選也常常遇到體內和體外藥效地不一致，使得其在二維培養條件下的行為會發生改變，不能很好地模仿bmsc微環境的天然結構。3d的培養環境是一個更貼近體內的條件，2d培養使得細胞只能從其背面接受基質傳來的物理信號，而3d培養的細胞可以從360°接受基質的物理信號，3d細胞培養系統的目的是通過重建組織結構并為細胞存活、增殖和分化提供有利的微環境來模擬活組織的原位功能，更類似于體內得環境。因此構建體外的3d
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題在于針對上述現有技術中的不足，提供一種基于功能化gelma水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統。本專利技術通過利用具有優異生物相容性和穩定性的復合導電水凝膠搭建體外3d細胞培養平臺，結合外部電刺激裝置，構建體外的模擬體內3d電微環境的3d培養系統，為體外研究細胞與基質間地相互作用及其相關機制，特別是細胞成骨誘導提供一個更仿真的平臺。
2、為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案是：一種基于功能化gelma水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，包括：通過復合導電水凝膠包裹細胞構建形成的水凝膠三維培養平臺以及用以為所述水凝膠三維培養平臺提供電刺激功能的電刺激裝置；
3、本專利技術中的復合導電水凝膠包括：甲基丙烯酸酯化改性明膠(gelma)、構成導電網絡的導電聚合物聚吡咯納米線(ppy納米線，也即ppynws)，增強聚合物平臺穩定性的高分子聚合物(pegda)。
4、所述水凝膠三維培養平臺通過以方法構建得到：
5、s1、制備gelma；
6、s2、制備ppy納米線；
7、s3、制備pegda；
8、s4、制備水凝膠前驅體溶液：
9、s4-1、構建水凝膠三維培養平臺：
10、s4-2、將gelma溶解于光引發劑溶液中，然后加入pegda，攪拌至完全溶解后再加入ppy納米線，超聲分散，得到水凝膠前驅體的溶液；
11、s4-3、將用于培養的細胞加入水凝膠前驅體的溶液中，紫外光照，使水凝膠前驅體固化成復合導電水凝膠并包裹細胞，構建形成所述水凝膠三維培養平臺。
12、優選的是，步驟s1具體為：
13、取10g?a型明膠固體粉末加入100ml?pbs溶液中，60℃下攪拌2h，避光下以0.5ml/min的速度滴加6ml甲基丙烯酸酐，反應3h，加入預熱至37℃的pbs溶液終止反應，產物使用8k-14k?da的透析袋在去離子水中透析7天，取透析袋內溶液冷凍干燥，得到gelma。
14、優選的是，步驟s2具體為：
15、取0.1g十六烷基三甲基溴化銨加入30ml濃度為0.5m的鹽酸溶液中，攪拌至完全溶解后以0.4ml/min的速度滴加0.3ml的吡咯單體，攪拌均勻，加入30ml濃度為0.5m且含有0.2g過硫酸銨的hcl溶液，于4℃、500rpm攪拌下反應8小時，11000rpm離心，收集固體產物，用去離子水和無水乙醇依次漂洗，干燥，得到ppy納米線。
16、優選的是，步驟s3具體為：
17、s3-1、取10-40g分子量為2000的peg固體加入30-120ml二氯甲烷中，攪拌至完全溶解，于0-10℃下依次加入0.2-0.8ml三乙胺和0.35-1.4ml丙烯酰氯，隨后在氮氣氛圍下反應24-96小時；
18、s3-2、反應結束后，向產物中加入10-40ml濃度為1-4mol/l的碳酸鉀溶液，所得反應液轉移至分液漏斗中，震蕩后靜置分層，取底層的二氯甲烷相反應液，加入硫酸鎂粉末除水，離心收集上清，旋蒸濃縮，向所得濃縮液中加入乙醚直至析出白色粉末固體，抽濾，并將收集到的白色固體樣品在20-40℃下真空干燥至恒重，得到pegda粗產品；
19、s3-3、pegda粗產品用透析袋在去離子水中透析36-144小時，冷凍干燥，得到純化后的pegda。
20、優選的是，步驟s3具體為：
21、s3-1、取20g分子量為2000的peg固體加入60ml二氯甲烷中，攪拌至完全溶解，于4℃下依次加入0.4ml三乙胺和0.7ml丙烯酰氯，隨后在氮氣氛圍下反應48小時；
22、s3-2、反應結束后，向產物中加入20ml濃度為2mol/l的碳酸鉀溶液，所得反應液轉移至分液漏斗中，震蕩后靜置分層，取底層的二氯甲烷相反應液，多次加入硫酸鎂粉末除水，離心收集上清，旋蒸濃縮，向所得濃縮液中加入乙醚直至析出白色粉末固體，抽濾，并將收集到的白色固體樣品轉移至25℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到pegda粗產品；
23、s3-3、pegda粗產品用截留分子量為2000da的透析袋在去離子水中透析72小時，-20℃下冷凍干燥，得到純化后的pegda。
24、優選的是，所述光引發劑溶液通過光引發劑lap和pbs溶液配制得到。
25、優選的是，步驟s4具體為：
26、s4-2、取50-200mg光引發劑lap加入50-200ml?pbs溶液中，40-60℃下避光攪拌0.5-2小時，得到光引發劑溶液；
27、取0.1875-0.75g步驟s1制備的gelma加入1-5ml的光引發劑溶液中，40-60℃下攪拌至完全溶解，然后加入1wt％-2wt％的步驟s3制備的pegda，攪拌1.5-6h后再加入0.5wt％-1.5wt％的步驟s2制備的ppy納米線，攪拌反應1.5-6hh，得到水凝膠前驅體的溶液；
28、s4-3、將用于培養的細胞加入水凝膠前驅體的溶液中，用405nm的紫外光照射45-180s，使水凝膠前驅體固化成復合導電水凝本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，包括通過復合導電水凝膠包裹細胞構建形成的水凝膠三維培養平臺以及用以為所述水凝膠三維培養平臺提供電刺激功能的電刺激裝置；
2.根據權利要求1所述的基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟S1具體為：
3.根據權利要求1所述的基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟S2具體為：
4.根據權利要求1所述的基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟S3具體為：
5.根據權利要求4所述的基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟S3具體為：
6.根據權利要求1所述的基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，所述光引發劑溶液通過光引發劑LAP和PBS溶液配制得到。
7.根據權利要求6所述的基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟S4具體為：
8.根據權利要求7所述的基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟S4具體為
9.根據權利要求1-8中任意一項所述的基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，所述電刺激裝置包括細胞培養孔板、設置在所述細胞培養孔板的培養孔內的正電極和負電極、與所述正電極和負電極連接的用于提供電刺激功能的電刺激主機。
10.根據權利要求9所述的基于功能化GelMA水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，該系統的電刺激方法為：
...【技術特征摘要】
1.一種基于功能化gelma水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，包括通過復合導電水凝膠包裹細胞構建形成的水凝膠三維培養平臺以及用以為所述水凝膠三維培養平臺提供電刺激功能的電刺激裝置；
2.根據權利要求1所述的基于功能化gelma水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟s1具體為：
3.根據權利要求1所述的基于功能化gelma水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟s2具體為：
4.根據權利要求1所述的基于功能化gelma水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟s3具體為：
5.根據權利要求4所述的基于功能化gelma水凝膠的體外三維細胞電刺激成骨誘導系統，其特征在于，步驟s3具體為：
6.根據權利要求1所述的基于功能化gelm...
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