【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于藍(lán)藻測(cè)序，具體涉及一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法及系統(tǒng)。
技術(shù)介紹
1、藍(lán)藻作為原核生物的重要類群，其多樣性及在生態(tài)系統(tǒng)中的作用日益受到關(guān)注；然而，傳統(tǒng)的藍(lán)藻16srna基因序列分析方法在序列覆蓋度、分類精度及對(duì)新物種的發(fā)現(xiàn)能力上存在局限；隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和深度學(xué)習(xí)算法的廣泛應(yīng)用，為構(gòu)建更高精度的藍(lán)藻序列數(shù)據(jù)庫(kù)提供了可能。
2、現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)：
3、數(shù)據(jù)冗余與不一致性：現(xiàn)有的藍(lán)藻16srna基因擴(kuò)增子序列數(shù)據(jù)庫(kù)往往存在數(shù)據(jù)冗余、序列質(zhì)量參差不齊以及物種命名不一致等問(wèn)題，導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析和比較時(shí)產(chǎn)生偏差；
4、分辨率與準(zhǔn)確性：由于藍(lán)藻16srna基因序列的保守性和變異性，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)在物種鑒定時(shí)的分辨率和準(zhǔn)確性有限，特別是對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種難以區(qū)分；
5、更新滯后：隨著高通量測(cè)序技術(shù)的普及和科研進(jìn)展的加速，新的藍(lán)藻物種和序列不斷涌現(xiàn)，但現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的更新速度往往滯后于科研需求，無(wú)法及時(shí)反映最新的研究成果；
6、缺乏集成化解決方案：現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)往往只關(guān)注于序列數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)和檢索，缺乏與生物信息學(xué)分析工具的集成，導(dǎo)致用戶需要花費(fèi)大量時(shí)間和精力進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析；
7、用戶界面不友好：部分現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)的用戶界面設(shè)計(jì)不夠直觀和友好，用戶操作復(fù)雜，不利于非專業(yè)人員的使用和推廣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法及系統(tǒng)，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性增強(qiáng)的擴(kuò)增引物、優(yōu)
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供如下技術(shù)方案：一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，包括
3、特異性擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證：
4、序列數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘：利用ncbi、silva數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)blast工具對(duì)藍(lán)藻16srna基因序列進(jìn)行廣泛比對(duì)與挖掘，識(shí)別保守且具藍(lán)藻特異性的序列區(qū)域；
5、引物設(shè)計(jì)：基于挖掘結(jié)果，采用primer3、oligo引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)多對(duì)候選擴(kuò)增引物；
6、引物驗(yàn)證：通過(guò)體外pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，評(píng)估候選引物的特異性、靈敏度及產(chǎn)物質(zhì)量，篩選出最優(yōu)引物對(duì)；
7、優(yōu)化測(cè)序策略與文庫(kù)構(gòu)建：
8、測(cè)序平臺(tái)選擇：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇高通量測(cè)序平臺(tái)；
9、測(cè)序深度與覆蓋度評(píng)估：利用模擬數(shù)據(jù)或已知群落數(shù)據(jù)評(píng)估最優(yōu)測(cè)序深度；
10、文庫(kù)構(gòu)建：采用優(yōu)化pcr條件擴(kuò)增藍(lán)藻樣本的16srna基因，經(jīng)純化、定量、末端修復(fù)構(gòu)建高質(zhì)量測(cè)序文庫(kù)；
11、高效自動(dòng)化生物信息學(xué)分析：
12、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：利用fastqc、trim?galore工具去除低質(zhì)量序列和污染；
13、序列去冗余與聚類：采用cd-hit、dada2工具去冗余并聚類為otu；
14、物種注釋與分類：將otu代表序列與權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)行物種注釋；
15、群落結(jié)構(gòu)分析：使用qiime?2、mothur軟件計(jì)算多樣性指數(shù)和距離矩陣，分析群落結(jié)構(gòu)；
16、標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果輸出與報(bào)告生成：
17、標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果輸出：將分析結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)化格式輸出，確保可比性；
18、報(bào)告生成：利用編程語(yǔ)言和圖形化工具生成詳細(xì)報(bào)告。
19、作為本專利技術(shù)的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，實(shí)驗(yàn)需求包括測(cè)序深度、通量、成本。
20、作為本專利技術(shù)的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括illumina、iontorrent。
21、作為本專利技術(shù)的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，設(shè)計(jì)多對(duì)候選擴(kuò)增引物中，引物設(shè)計(jì)考慮熔解溫度、gc含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)形成潛力及引物間互補(bǔ)性因素。
22、作為本專利技術(shù)的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，將otu代表序列與權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)包括silva、greengenes。
23、作為本專利技術(shù)的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述多樣性指數(shù)包括shannon指數(shù)、simpson指數(shù)。
24、作為本專利技術(shù)的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，利用編程語(yǔ)言和圖形化工具生成詳細(xì)報(bào)告中，利用r語(yǔ)言、python編程語(yǔ)言，結(jié)合圖形化工具ggplot2、seaborn，生成包含分析結(jié)果、圖表及討論的詳細(xì)技術(shù)報(bào)告或科學(xué)論文。
25、作為本專利技術(shù)的一種優(yōu)選的技術(shù)方案，優(yōu)化pcr條件包括變性溫度、退火溫度、延伸溫度、循環(huán)數(shù)。
26、本專利技術(shù)還公開了一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序系統(tǒng)，包括
27、特異性擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)模塊：
28、數(shù)據(jù)庫(kù)接口：連接ncbi、silva數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行藍(lán)藻16srna基因序列挖掘；
29、引物設(shè)計(jì)軟件：集成primer3、oligo軟件，自動(dòng)設(shè)計(jì)并篩選特異性擴(kuò)增引物；
30、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證平臺(tái)：支持體外pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證引物特異性和效率；
31、優(yōu)化測(cè)序策略與文庫(kù)構(gòu)建模塊：
32、測(cè)序平臺(tái)選擇工具：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求推薦最優(yōu)測(cè)序平臺(tái)；
33、測(cè)序深度評(píng)估模型：基于模擬或已知數(shù)據(jù)評(píng)估最優(yōu)測(cè)序深度；
34、文庫(kù)構(gòu)建自動(dòng)化工作站：集成pcr擴(kuò)增、純化、定量、文庫(kù)構(gòu)建步驟的自動(dòng)化設(shè)備；
35、高效自動(dòng)化生物信息學(xué)分析模塊：
36、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制軟件：集成fastqc、trim?galore工具，自動(dòng)去除低質(zhì)量序列和污染；
37、序列處理與分析平臺(tái)：支持cd-hit、dada2去冗余，blast、rdp?classifier物種注釋，qiime?2、mothur群落結(jié)構(gòu)分析；
38、結(jié)果可視化工具：集成ggplot2、seaborn圖形化工具，生成直觀的分析圖表；
39、標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果輸出與報(bào)告生成模塊：
40、標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果輸出模塊：自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)化格式的分析結(jié)果；
41、報(bào)告生成器：編程語(yǔ)言和模板結(jié)合，快速生成包含分析結(jié)果、圖表及討論的技術(shù)報(bào)告或科學(xué)論文。
42、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有益效果是：
43、通過(guò)設(shè)計(jì)特異性增強(qiáng)的擴(kuò)增引物、優(yōu)化測(cè)序策略以實(shí)現(xiàn)高覆蓋度測(cè)序、開發(fā)高效自動(dòng)化生物信息學(xué)分析流程，并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化物種注釋與群落結(jié)構(gòu)分析體系，從而顯著提升分析精度、效率及結(jié)果的可比性與可重復(fù)性；
44、高通量測(cè)序技術(shù)能夠同時(shí)處理大量樣本，極大地提高了測(cè)序效率，使得在短時(shí)間內(nèi)獲取大量藍(lán)藻16srna基因序列成為可能；
45、能夠檢測(cè)到樣本中極低豐度的微生物，有助于發(fā)現(xiàn)稀有或未被充分研究的藍(lán)藻種類；
46、隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和普及，測(cè)序成本逐漸降低，使得更多的研究機(jī)構(gòu)和個(gè)人能夠承擔(dān)得起藍(lán)藻16srna基因測(cè)序的費(fèi)用；
47、16srna基因測(cè)序技術(shù)不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，可以直接從環(huán)境樣本中提取dna進(jìn)行測(cè)序，避免了培養(yǎng)過(guò)程中本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：包括
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：實(shí)驗(yàn)需求包括測(cè)序深度、通量、成本。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括Illumina、Ion?Torrent。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：設(shè)計(jì)多對(duì)候選擴(kuò)增引物中，引物設(shè)計(jì)考慮熔解溫度、GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)形成潛力及引物間互補(bǔ)性因素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：將OTU代表序列與權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)包括SILVA、Greengenes。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：所述多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：利用編程語(yǔ)言和圖形化工具生成詳細(xì)報(bào)告中，利用R語(yǔ)言、Python編程語(yǔ)言，結(jié)合圖形化工具gg
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：優(yōu)化PCR條件包括變性溫度、退火溫度、延伸溫度、循環(huán)數(shù)。
9.一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序系統(tǒng)，其特征在于：包括
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：包括
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：實(shí)驗(yàn)需求包括測(cè)序深度、通量、成本。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括illumina、ion?torrent。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：設(shè)計(jì)多對(duì)候選擴(kuò)增引物中，引物設(shè)計(jì)考慮熔解溫度、gc含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)形成潛力及引物間互補(bǔ)性因素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種16srna藍(lán)藻高通量測(cè)序方法，其特征在于：將otu代表序列與權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)包括sil...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張軍毅，孫蓓麗，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇宏眾百德生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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