【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細菌檢測，具體涉及一種福氏志賀氏菌的特異性分子靶標及其熒光定量pcr檢測方法。
技術介紹
1、志賀氏菌是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧、無芽孢、不活動且通常不含乳糖的桿狀細菌，在100年前由日本科學家首次發現，志賀氏菌病是一種通過糞-口途徑感染引起的高度傳染性和嚴重的炎癥性腹瀉。它在發展中國家的高發病率和高死亡率在全球引起關注。志賀氏菌分為四種：痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋內志賀氏菌，而福氏志賀氏菌是適度性最強的血清型。在發展中國家和發達國家，發現大約60%的細菌性痢疾是由福氏志賀氏菌引起的。福氏志賀氏菌主要生長在酸性條件和鹽堿環境中。此外，福氏志賀氏菌極易毒害各種食物，如蔬菜、肉類、面包、牛奶等。福氏志賀氏菌菌株會侵入人體的結腸和直腸上皮，并誘導強烈的炎癥反應，最終導致嚴重的組織損傷，這表現為一系列臨床癥狀，從水樣腹瀉到以發熱、腹部絞痛和血性粘液樣糞便為特征。福氏志賀氏菌具有高度傳染性，只有10-100個細菌細胞就能夠引起感染。為了維護全球健康和食品安全，早期發現福氏志賀氏菌對于準確診斷傳染病和快速控制疫情至關重要。
2、目前，常規國家標準方法是細菌富集和選擇性培養，其次是生化和血清學方法進行檢測和分型。然而，這個過程往往需要幾天時間，這使得檢測效率極低。隨著分子生物學技術的發展，特別是熒光qpcr技術在含有志賀氏菌病原體的檢測和鑒定中的應用越來越廣泛。
3、基于分子生物學的核酸擴增方法檢測結果的準確性主要取決于高質量的檢測靶標。然而，熒光qpcr是分子學檢測的金標準，其引物的設
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術的不足，通過泛基因組分析進一步挖掘福氏志賀氏菌的特異性靶標，從而提供了一種基于新靶標的taqman熒光定量pcr檢測方法。
2、本專利技術是通過以下技術方案實驗的：
3、一種用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標，所述特異性分子靶標的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、一組上述用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標的引物，特異性分子靶標seqid?no.1的上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2和seq?id?no.5所示，下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.6所示。
5、一組上述用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標的taqman探針，?taqman探針的核苷酸序列如seq?id?no.4和seq?id?no.7所示。所述taqman探針的5’端標記報告熒光染料為fam，3’端標記熒光淬滅基團為bhq1。
6、上述的用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標在制備檢測福氏志賀氏菌的試劑中的應用。
7、一種用于檢測福氏志賀氏菌的試劑盒，包括seq?id?no.1-7所述的全部核苷酸序列。
8、一種非疾病診斷治療目的的檢測福氏志賀氏菌的方法，包括以下步驟：
9、（1）獲得待檢微生物的dna，以提取的dna為模板采用特異性分子靶標seq?id?no.1進行引物和探針設計；
10、（2）將根據特異性分子靶標seq?id?no.1所設計的引物和探針進行qpcr擴增，并收集熒光信號；
11、（3）結果判定：根據步驟（2）收集到的熒光信號及ct值判斷樣品中是否含有福氏志賀氏菌，當ct值大于35或系統判定為陰性時，結果判定為陰性。
12、作為優選的，在上述的檢測福氏志賀氏菌的方法中，所述的qpcr擴增的反應體系為10ml2×pro?taq?hs?probe?premix，初始濃度為10μm的上下游引物各0.7μl，初始濃度為10μm的探針1μl，模板與ddh2o體積和為7.6μl，體系總體積為20μl。
13、作為優選的，在上述的檢測福氏志賀氏菌的方法中，所述qpcr擴增的反應程序為：熒光通道設置為溫控，程序設置為95℃?5min；40個循環包括95℃15s，60℃30s；qpcr儀器熒光通道設置為：fam，同時以qpcr儀器收集熒光信號。
14、本專利技術的有益效果如下：
15、本專利技術公開了用于鑒別福氏志賀氏菌的特異性分子序列，并提供相關的特異性引物和探針序列，以及相對應的qpcr檢測方法。本專利技術對福氏志賀氏菌的檢測靈敏度可達到3.9×102cfu/ml，同時具有較好的特異性及重復性，為福氏志賀氏菌的檢測提供了一種簡便、快捷、高效和低成本的方法。
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1.一種用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標，其特征在于所述特異性分子靶標的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.一組如權利要求1所述的用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標的引物，其特征在于，特異性分子靶標SEQ?ID?NO.1的上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2和SEQ?IDNO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.6所示。
3.一組如權利要求1所述的用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標的TaqMan探針，其特征在于，TaqMan探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4和SEQ?ID?NO.7所示。
4.如權利要求3所述的用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標的TaqMan探針，其特征在于，所述TaqMan探針的5’端標記報告熒光染料為FAM，3’端標記熒光淬滅基團為BHQ1。
5.權利要求1所述的用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標在制備檢測福氏志賀氏菌的試劑中的應用。
6.一種用于檢測福氏志賀氏菌的試劑盒，其特征在于，包括SEQ?ID?NO.1-7所述的全部核苷
7.一種非疾病診斷治療目的的檢測福氏志賀氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.如權利要求7所述的檢測福氏志賀氏菌的方法，其特征在于，所述的qPCR擴增的反應體系為10mL2×Pro?Taq?HS?Probe?Premix，初始濃度為10μM的上下游引物各0.7μL，初始濃度為10μM的探針1μL，模板與ddH2O體積和為7.6μL，體系總體積為20μL。
9.如權利要求7所述的檢測福氏志賀氏菌的方法，其特征在于，所述qPCR擴增的反應程序為：熒光通道設置為溫控，程序設置為95℃?5min；40個循環包括95℃15s，60℃30s；qPCR儀器熒光通道設置為：FAM，同時以qPCR儀器收集熒光信號。
...【技術特征摘要】
1.一種用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標，其特征在于所述特異性分子靶標的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一組如權利要求1所述的用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標的引物，其特征在于，特異性分子靶標seq?id?no.1的上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.2和seq?idno.5所示，下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.3和seq?id?no.6所示。
3.一組如權利要求1所述的用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標的taqman探針，其特征在于，taqman探針的核苷酸序列如seq?id?no.4和seq?id?no.7所示。
4.如權利要求3所述的用于檢測福氏志賀氏菌的特異性分子靶標的taqman探針，其特征在于，所述taqman探針的5’端標記報告熒光染料為fam，3’端標記熒光淬滅基團為bhq1。
5.權利要求1所述的用于檢測福氏志...
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