【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于醫(yī)藥，具體的涉及一種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法。
技術(shù)介紹
1、半月板是膝關(guān)節(jié)內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)，半月板損傷也是患病率最高的膝關(guān)節(jié)損傷，平均每年的發(fā)生率為0.66％。半月板有許多重要的生物力學(xué)功能，包括傳遞負(fù)荷，吸收震蕩，穩(wěn)定關(guān)節(jié)及潤滑營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨等。鑒于半月板的重要功能，在其損傷后的治療中應(yīng)盡量予以保留和修復(fù)。然而，半月板組織基本上是無血管的，其致密的細(xì)胞外基質(zhì)限制了相對較少的細(xì)胞的流動性和增殖潛能。因此，半月板自我修復(fù)的能力非常有限。
2、本專利技術(shù)材料保留了許多半月板固有成分和生物活性因子，作為一種新型的半月板損傷修復(fù)材料在臨床治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)提供了一種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，所述的制備方法包括：
2、a)取半月板切塊，循環(huán)凍融，浸泡于1%過氧化氫中處理1-2h，經(jīng)pbs溶液洗滌，置于去離子水中冷凍；
3、b)浸泡于0.4%-0.8%胰蛋白酶中，37℃孵育2-3分鐘，終止消化；
4、c)將步驟b)制備的樣品依次置于pbs溶液、5%-8%?triton?x-100溶液、5%-8%脫氧膽酸鈉溶液、2%-4%?triton?x-100溶液和pbs溶液中，每種溶液4oc恒溫震蕩24-36h，每種溶液處理后用pbs洗滌，制備得到脫細(xì)胞半月板；
5、d)將脫細(xì)胞半月板冷凍干燥，粉碎，用消化液消化，然后用naoh水溶液和10×pbs中和反應(yīng)粘性溶液，置于37℃下，制備
6、本專利技術(shù)首先進(jìn)行脫細(xì)胞外基質(zhì)處理，采用循環(huán)凍融的方式能夠更充分裂解細(xì)胞。經(jīng)1%過氧化氫中處理，可以有效地破壞細(xì)胞膜的通透性。之后將樣品依次置于pbs溶液、triton?x-100溶液、脫氧膽酸鈉溶液、triton?x-100溶液和pbs溶液中次進(jìn)行處理，去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞核成分，增加組織的孔隙度通過上述方法獲得的脫細(xì)胞外基質(zhì)免疫原性成分清除率高,且保留了大量的膠原蛋白和gag，具有良好的生物活性。進(jìn)一步，制備成的水凝膠微孔內(nèi)存在納米纖維結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供了粘附位點(diǎn)，有利于細(xì)胞穩(wěn)定粘附和增殖，對于組織修復(fù)具有更好的促進(jìn)作用。
7、在一些實(shí)施方案中，步驟a)中，所述循環(huán)凍融的過程包括：將半月板切塊后，置于去離子水中，冰凍，復(fù)融；再置于10%nacl溶液中，冰凍，復(fù)融。
8、在一些實(shí)施方案中，步驟a)中，所述循環(huán)凍融的過程包括：將半月板切塊后，置于去離子水中，-80℃冰凍1-2h，后于37℃下復(fù)融；再置于10%nacl溶液中，-80℃冰凍1-2h，后于37℃下復(fù)融。
9、在一些實(shí)施方案中，步驟b)中，采用bsa終止消化。
10、在一些實(shí)施方案中，步驟b)中，所述胰蛋白酶的濃度為5%。
11、在一些實(shí)施方案中，步驟c)中，將步驟b)制備的樣品依次置于pbs溶液、5%?tritonx-100溶液、6%脫氧膽酸鈉溶液、3%?triton?x-100溶液和pbs溶液中，每種溶液4oc恒溫震蕩24h，每種溶液處理后用pbs洗滌，制備得到脫細(xì)胞半月板。
12、在一些實(shí)施方案中，步驟d）中，所述消化液為含有胃蛋白酶的hcl水溶液。
13、在一些實(shí)施方案中，步驟d)中，所述胃蛋白酶與所述脫細(xì)胞半月板的質(zhì)量比為1:5~20。優(yōu)選的，質(zhì)量比為1:10。
14、在一些實(shí)施方案中，步驟d)中，將所述脫細(xì)胞半月板冷凍干燥，粉碎，置于含有胃蛋白酶的0.01m?hcl水溶液中，在室溫下攪拌至形成流動性粘液溶液，用naoh水溶液和10×pbs中和反應(yīng)粘性溶液，放置于37℃下靜置數(shù)分鐘即可制備得到細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠。
15、有益效果：
16、1、本專利技術(shù)的脫細(xì)胞基質(zhì)的成分與天然組織成分基本接近，可以提供良好的生物功能。
17、2、本專利技術(shù)的脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠制備方法的成型條件為正常的人體生理?xiàng)l件，適宜體內(nèi)應(yīng)用，可直接注射使用，也可體外成型后植入體內(nèi)使用。
18、3、本專利技術(shù)在脫細(xì)胞基質(zhì)制備過程中，通過將樣品將依次置于pbs溶液、triton?x-100溶液、脫氧膽酸鈉溶液、triton?x-100溶液和pbs溶液中進(jìn)行處理，有效的去除免疫原性成分，增加組織的孔隙度，制備得到的細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠可以自發(fā)的形成納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供了粘附位點(diǎn)，有利于細(xì)胞穩(wěn)定粘附和增殖，對于組織修復(fù)具有很好的促進(jìn)作用。
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1.一種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：所述的制備方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟A)中，所述循環(huán)凍融的過程包括：將半月板切塊后，置于去離子水中，冰凍，復(fù)融；再置于10%NaCl溶液中，冰凍，復(fù)融。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟A)中，所述循環(huán)凍融的過程包括：將半月板切塊后，置于去離子水中，-80℃冰凍1-2h，后于37℃下復(fù)融；再置于10%NaCl溶液中，-80℃冰凍1-2h，后于37℃下復(fù)融。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟B)中，采用BSA終止消化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟B)中，所述胰蛋白酶的濃度為5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟C)中，將步驟B)制備的樣品依次置于PBS溶液、5%?Triton?X-100溶液、6%脫氧膽酸鈉溶液、3%Trit
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟D）中，所述消化液為含有胃蛋白酶的HCl水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟D)中，所述胃蛋白酶與所述脫細(xì)胞半月板的質(zhì)量比為1:5~20。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：所述胃蛋白酶與所述脫細(xì)胞半月板的質(zhì)量比為1:10。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：所述的制備方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟a)中，所述循環(huán)凍融的過程包括：將半月板切塊后，置于去離子水中，冰凍，復(fù)融；再置于10%nacl溶液中，冰凍，復(fù)融。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟a)中，所述循環(huán)凍融的過程包括：將半月板切塊后，置于去離子水中，-80℃冰凍1-2h，后于37℃下復(fù)融；再置于10%nacl溶液中，-80℃冰凍1-2h，后于37℃下復(fù)融。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟b)中，采用bsa終止消化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種半月板細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠的制備方法，其特征在于：步驟b)中，所述胰蛋...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：柯春海，馬靜云，馮培培，賀超楠，
申請(專利權(quán))人：寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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