【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體涉及純化6-唾液酸乳糖的方法。
技術介紹
1、母乳低聚糖(hmos)是一類復合低聚糖，由單糖及衍生物、唾液酸等結構單元通過糖苷鍵連接而成。hmos是人乳中含量占比第三大的固體成分，僅次于乳糖及脂肪，具有多種重要的生理學功能。目前已有研究表明，6-唾液酸乳糖具有良好的抗菌活性及免疫調節功能，對于改善腸道菌群微生態、維持腸屏障抵抗病原菌感染等有著積極作用，并對嬰幼兒的大腦發育提供重要支持，6-唾液酸乳糖含量已成為嬰幼兒配方奶粉中的關鍵營養指標。
2、盡管6-唾液酸乳糖具有重要的生理學作用，但目前在工業上尚無快速、批量、經濟和安全的生產方法。由于母乳寡糖化學合成充滿挑戰，因此開發了多酶聯合催化生產母乳低聚糖。多酶聯合催化生產寡糖過程中通常伴隨多種副反應產物的生成。反應液中通常包括了未反應完的底物(乳糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖和乙酰氨基葡等)、反應中間產物(乳糖-1-磷酸、半乳糖-1-磷酸和udp-乙酰氨基葡萄糖等)和各種副反應產物。
3、特別是在6-唾液酸乳糖的多酶聯合催化生產過程中，由于糖基轉移酶的專一性問題和乳糖酶在粗酶液中的廣泛存在，不可避免的會有3-唾液酸乳糖、6-唾液酸半乳糖、3-唾液酸半乳糖等雜質生成，此外乳糖自身又容易在異構酶的存在下生成乳果糖并在后續糖基轉移酶的作用下生成唾液酸乳果糖等。同時糖類在高溫下也會生成醛醇或發生美拉德反應。在大多數情況下，母乳低聚糖的純化難度更高，成本也相對更高。
4、現有工藝指出可以通過超濾、納濾、活性炭處理或其任意組合預處理包含發
5、目前針對酶催化反應液中6-唾液酸乳糖的下游分離提純研究較少，現有的純化工藝均僅通過膜分離和離子交換來去除其中的糖類等雜質，因此純度只達到90％左右，并且存在廢水多、成本效益低，難以進行規模化生產的問題。同時，有專利提到可以通過模擬移動床色譜對人乳寡糖進行精細純化，但所得產物純度同樣只達到90％。盡管模擬移動床色譜具有較好的分離效果，但是考慮到6-唾液酸乳糖的酶催化液中的副反應產物和底物與6-唾液酸乳糖性質相似程度高，單純使用模擬移動床的分離提純效果有限。
6、因此開發高純度和低成本的6-唾液酸乳糖的分離純化方法對工業生產、產品推廣等方面具有重要的意義。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術提供了純化6-唾液酸乳糖的方法。
2、本專利技術提供了純化6-唾液酸乳糖的方法。本專利技術基于多酶催化制備的6-唾液酸乳糖酶反應液，通過結合膜分離和模擬移動床色譜技術，開發一種高效高純度高回收率的6-唾液酸乳糖的純化方法，同時產生的廢水少，成本效益高，可連續規模化生產。
3、為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：
4、本專利技術提供了1、純化6-唾液酸乳糖的方法，其特征在于，包括如下步驟：
5、步驟1：取6-唾液酸乳糖的酶反應液加熱，離心，獲得6-唾液酸乳糖粗品反應液；
6、步驟2：取所述6-唾液酸乳糖粗品反應液經超濾、納濾，獲得6-唾液酸乳糖過濾液；
7、步驟3：取所述6-唾液酸乳糖過濾液經模擬移動床色譜，獲得6-唾液酸乳糖純化液；
8、步驟4：取所述6-唾液酸乳糖純化液經噴霧干燥，獲得6-唾液酸乳糖成品。
9、在本專利技術的一些具體實施方案中，所述離心包括：8000rpm，30min。
10、在本專利技術的一些具體實施方案中，步驟1中所述6-唾液酸乳糖的酶反應液包括6-唾液酸乳糖、6-唾液酸乳果糖、6-唾液酸半乳糖或唾液酸中的一種或多種。
11、在本專利技術的一些具體實施方案中，所述6-唾液酸乳糖的含量為81.2％；所述6-唾液酸乳果糖的含量為7.5％；所述6-唾液酸半乳糖的含量為6.9％；所述唾液酸的含量為4.4％。
12、在本專利技術的一些具體實施方案中，所述6-唾液酸乳糖的酶反應液的制備方法包括如下步驟：
13、步驟(1)：取含exo-α-唾液酸苷酶的重組大腸桿菌bl21菌體與水混合，破胞，獲得exo-α-唾液酸苷酶酶液；
14、步驟(2)：取唾液酸溶液與乳糖溶液混合后的溶液與所述exo-α-唾液酸苷酶酶液混合，攪拌，獲得所述6-唾液酸乳糖的酶反應液。
15、在本專利技術的一些具體實施方案中，步驟(1)中所述含exo-α-唾液酸苷酶的重組大腸桿菌bl21菌體采用中國專利cn108220310a中的實施例獲得。
16、在本專利技術的一些具體實施方案中，步驟(1)中所述破胞壓力為800～1000bar。
17、在本專利技術的一些具體實施方案中，步驟(1)中所述含exo-α-唾液酸苷酶的重組大腸桿菌bl21菌體與水的比例為1:4(m/m)。
18、在本專利技術的一些具體實施方案中，步驟(2)中所述唾液酸溶液的濃度為0.3mol/l；
19、所述乳糖溶液的濃度為0.4mol/l。
20、在本專利技術的一些具體實施方案中，步驟(2)中所述唾液酸溶液與乳糖溶液混合的比例為1：1(v/v)。
21、在本專利技術的一些具體實施方案中，所述6-唾液酸乳糖的酶反應液的制備方法具體包括：
22、(1)exo-α-唾液酸苷酶酶液制備：根據反應所需酶量稱取適量含exo-α-唾液酸苷酶的重組大腸桿菌bl21菌體，分別將菌體與純化水按1:4(m/m)混合并攪拌至無塊狀物，使菌液呈懸濁液狀態；將菌液用高壓均質機在5～10℃、破胞壓力800～1000bar范圍內破胞兩次；
23、(2)酶反應：配置0.3mol/l唾液酸溶液和0.4mol/l乳糖溶液，以1：1(v/v)比例進行混合，而后在25℃攪拌下加入exo-α-唾液酸苷酶酶液，調ph至6.5～7.5；于25℃，轉速100rpm條件下攪拌6h，在6h后停止攪拌結束反應制得6-唾液酸乳糖的酶反應液。
24、在本專利技術的一些具體實施方案中，步驟1中所述加熱的溫度為40～90℃，加熱的時間為10～90min。
25、在本專利技術的一些具體實施方案中，所述加熱的溫度為50～70℃，加熱的時間為30～90min。
26、在本專利技術的一些具體實施方案中，所述加熱的時間為30～60min。
27、在本專利技術的一些具體實施方案中，步驟2中所述超濾采用的膜的截留分子量包括10～50kda。...
【技術保護點】
1.純化6-唾液酸乳糖的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中所述6-唾液酸乳糖的酶反應液包括6-唾液酸乳糖、6-唾液酸乳果糖、6-唾液酸半乳糖或唾液酸中的一種或多種。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述6-唾液酸乳糖的酶反應液的制備方法包括如下步驟：
4.如權利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，步驟1中所述加熱的溫度為40～90℃，加熱的時間為10～90min。
5.如權利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，步驟2中所述超濾采用的膜的截留分子量包括10～50KDa。
6.如權利要求1至5任一項所述的方法，其特征在于，步驟2中所述納濾采用的膜的截留分子量包括300D～1000D。
7.如權利要求1至6任一項所述的方法，其特征在于，步驟3中所述模擬移動床色譜包括：
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟3所述模擬移動床色譜包括：
9.如權利要求1至8任一項所述的方法，其特征在于，步驟4中所述噴霧干燥的進樣速度包括2
10.如權利要求1至9任一項所述的方法，其特征在于，所述6-唾液酸乳糖過濾液的pH值為3～7。
...【技術特征摘要】
1.純化6-唾液酸乳糖的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中所述6-唾液酸乳糖的酶反應液包括6-唾液酸乳糖、6-唾液酸乳果糖、6-唾液酸半乳糖或唾液酸中的一種或多種。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述6-唾液酸乳糖的酶反應液的制備方法包括如下步驟：
4.如權利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于，步驟1中所述加熱的溫度為40～90℃，加熱的時間為10～90min。
5.如權利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，步驟2中所述超濾采用的膜的截留分...
【專利技術屬性】
技術研發人員：方鄭，戴柱，王斌，張煒，呂夢瑤，于鐵妹，潘俊鋒，劉建，
申請(專利權)人：深圳瑞德林生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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