本發(fā)明專利技術屬于細胞生物學和組織工程學技術領域，具體涉及骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系及其構建方法。本發(fā)明專利技術將骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元接種在聚乳酸?羥基乙酸多孔細胞支架上進行共培養(yǎng)，能更好模擬腦內(nèi)細胞移植時骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸狀態(tài)，增加骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元的接觸面積，建立體外細胞間接觸模型，用于研究接觸細胞之間的機械作用力和細胞間通訊等。此外，將骨髓間充質干細胞進行綠色熒光蛋白標記，可以在熒光顯微鏡下與神經(jīng)元區(qū)分開，也容易將骨髓間充質干細胞從其與神經(jīng)元的混合細胞中分離出來，為后續(xù)研究奠定基礎。
1、近年來，基礎研究和臨床試驗均顯示骨髓間充質干細胞是移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想種子細胞之一，但骨髓間充質干細胞在腦內(nèi)的生物學特性尚不完全清楚。就目前的研究而言，一方面，骨髓間充質干細胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有益作用機制主要包括細胞替代、抑制神經(jīng)炎癥、促進血管生成、分泌細胞因子等；另一方面，神經(jīng)組織微環(huán)境通過一些細胞因子、生長因子等對骨髓間充質干細胞也起作用。然而，對于神經(jīng)組織微環(huán)境中不可忽略的因素—神經(jīng)元接觸對骨髓間充質干細胞生物學特性的影響鮮有研究。
2、申請?zhí)枮?01510504338.5的中國專利公開了一種間充質干細胞的三維共培養(yǎng)誘導方法，該方法將間充質干細胞與含有磁性氧化物包裹于凝膠球a中；將目的細胞源包裹于凝膠球b中；用誘導劑對凝膠球a內(nèi)的間充質干細胞和凝膠球b中的目的細胞源進行共培養(yǎng)至間充質干細胞轉化為目的細胞，然后將凝膠球a和凝膠球b置于磁場中進行分離，該專利建立了間充質干細胞與目的細胞共培養(yǎng)并又可將兩種細胞分開的方法。但是，該方法無法真實模擬間充質干細胞移植時與宿主細胞間的接觸狀態(tài)，忽略了接觸細胞之間的機械作用力和細胞間通訊，以及間充質干細胞的遷移特性。
3、細胞之間不僅能通過分泌細胞因子等相互影響，而且細胞也會對鄰近接觸細胞之間的機械作用力和細胞間通訊發(fā)生反應。普通的單層細胞培養(yǎng)和雙層細胞培養(yǎng)很難模擬腦內(nèi)骨髓間充質干細胞移植時與神經(jīng)元的三維接觸狀態(tài)。
>技術實現(xiàn)思路1、本專利技術的目的在于利用組織工程與細胞生物學技術，將帶有綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元混合接種在聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架上共培養(yǎng)，實現(xiàn)神經(jīng)元與骨髓間充質干細胞三維接觸，模擬構建體外細胞移植模型，還可利用綠色熒光蛋白標記將骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元分開，以觀察兩種細胞間的接觸作用為基礎，為后續(xù)眾多研究提供技術方法和實驗工具。
2、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、首先，本專利技術提供一種骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，包括以下步驟：
4、s1、將乳酸和羥基乙酸溶于有機溶劑中，再與致孔劑混合后放入模具中成型，脫模，去除氯化鈉致孔劑后干燥，得到聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架，將所述聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架裁剪成特定尺寸，然后依次進行消毒、清洗和多聚賴氨酸浸泡處理，將處理后的所述聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架置于第一培養(yǎng)板中，于無菌條件下晾干，然后孔內(nèi)加入α-mem浸泡過夜，將處理后的所述聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架轉移至第二培養(yǎng)板中干；
5、s2、制備綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質干細胞的細胞懸液；
6、s3、制備原代神經(jīng)元的細胞懸液；
7、s4、將綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質干細胞的細胞懸液與神經(jīng)元的細胞懸液混合，然后多點位注射入第二培養(yǎng)板中的所述聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架上培養(yǎng)，3-4小時后換液，棄去培養(yǎng)基和未貼壁細胞，加入含阿糖胞苷的神經(jīng)元專用培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6-7天，制得骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系。
8、進一步的，s1中，乳酸和羥基乙酸的摩爾比為80：20。
9、進一步的，s1中，有機溶劑為二氯甲烷，乳酸和羥基乙酸兩者與二氯甲烷的質量體積比為1g：6-10ml。
10、進一步的，s1中，致孔劑為粒徑180～250μm的氯化鈉顆粒。
11、進一步的，s1中，乳酸和羥基乙酸兩者與致孔劑的質量比為1:15～1:22。
12、進一步的，s2中，制備綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質干細胞的細胞懸液包括以下步驟：
13、a1、分離1月齡大鼠的雙側脛骨和股骨，用磷酸鹽緩沖液沖洗骨髓腔獲得細胞懸液；
14、a2、將a1所述細胞懸液加入大鼠淋巴細胞分離液上方，離心收取界面細胞層；
15、a3、將a2所述界面細胞層的細胞用含10％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)基重懸，接種在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2小時；
16、a4、全量換液去除a3中未貼壁細胞和雜質，此后每2～3天換液1次；
17、a5、a4所得細胞培養(yǎng)達約80％融合時，用胰酶消化液消化細胞，然后離心并用10％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)基重懸細胞再傳代培養(yǎng)；
18、a6、a5的傳代細胞達60％-70％融合時，加入帶有綠色熒光蛋白基因的重組慢病毒孵育48小時；
19、a7、a6培養(yǎng)的細胞用胰酶消化液消化，然后離心去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，在24-48小時觀察熒光表達情況；
20、a8、a7培養(yǎng)的細胞經(jīng)消化后重懸并調(diào)整細胞濃度為10個/ml，96孔板每孔加入100μl細胞懸液，在倒置熒光顯微鏡下觀察并挑選出表達gfp且為單細胞的孔，進行標記并擴大培養(yǎng)。
21、進一步的，s3中，制備原代神經(jīng)元的細胞懸液包括以下步驟：
22、b1、分離出生24小時以內(nèi)的乳大鼠大腦皮層并剪碎，加入消化酶溶液并放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化，期間用吸管吹打1-2次；
23、b2、向b1的腦組織中加入含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液終止消化并制成混懸液，滴入100μm孔徑的細胞篩過濾獲得第一細胞懸液；
24、b3、將b2的第一細胞懸液離心后去除上清，用10％胎牛血清的α-mem培養(yǎng)液重懸沉淀物，靜置-5-10分鐘去除成纖維細胞獲得第二細胞懸液，即所述原代神經(jīng)元的細胞懸液。
25、更進一步的，s4中，綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元的數(shù)量比為1：2～4。
26、其次，本專利技術提供上述構建方法構建得到的骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系。
27、有益效果：
28、(1)本專利技術通過生物工程、細胞生物學手段構建一種帶gfp標記的骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系，可以較真實的模擬腦內(nèi)骨髓間充質干細胞移植時與神經(jīng)元的三維接觸狀態(tài)，接觸細胞之間的機械作用力和細胞間通訊，以及間充質干細胞的遷移特性，用于體外細胞實驗研究，可以使研究結果更準確。
29、(2)制備的聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架空隙率高、空隙連通性良好、孔徑大小合適，有利于細胞遷移和接觸。
30、(3)通過選擇合適的帶gfp標記的骨髓間充質干細胞和神經(jīng)元在聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架上的接種量，保證細胞的營養(yǎng)獲取和代謝廢物的排出，促進細胞的新陳代謝。
31、(4)通過選擇合適的帶gfp標記的骨髓間充質干細胞和神經(jīng)元在聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架上的接種比例，增加了骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元的接觸面積，從而更好模擬腦內(nèi)移植骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元的接觸狀況。
32、(5)對骨髓間充質干細胞進行gfp標記，方便在熒光顯微鏡下將其與神經(jīng)元區(qū)分開；也可借助流式細胞術將兩種混合細胞分開，方便后續(xù)研究。
本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，S1中，乳酸和羥基乙酸的摩爾比為80：20。
3.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，S1中，有機溶劑為二氯甲烷，乳酸和羥基乙酸兩者與二氯甲烷的質量體積比為1g：6～10ml。
4.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，S1中，致孔劑為粒徑180～250μm的氯化鈉顆粒。
5.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，S1中，乳酸和羥基乙酸兩者與致孔劑的質量比為1:15～1:22。
6.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，S2中，制備綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質干細胞的細胞懸液包括以下步驟：
7.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，S3中，制備原代神經(jīng)元的細胞懸液包括以下步驟：
8.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，S4中，綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元的數(shù)量比為1：2～4。
9.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，S4中，綠色熒光蛋白標記的骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元在聚乳酸-羥基乙酸多孔細胞支架上的接種密度為2×106/cm3～5×106/cm3。
10.權利要求1～9任一項所述構建方法構建得到的骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系。
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【技術特征摘要】
1.一種骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，s1中，乳酸和羥基乙酸的摩爾比為80：20。
3.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，s1中，有機溶劑為二氯甲烷，乳酸和羥基乙酸兩者與二氯甲烷的質量體積比為1g：6～10ml。
4.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，s1中，致孔劑為粒徑180～250μm的氯化鈉顆粒。
5.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質干細胞與神經(jīng)元三維接觸共培養(yǎng)體系的構建方法，其特征在于，s1中，乳酸和羥基乙酸兩者與致孔劑的質量比為1:15～1:22。
6.根據(jù)權利要求1所述骨髓間充質...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：楊朝鮮，許娜，廖潤德，孫梓桓，周平，李惠然，謝冰清，
申請(專利權)人：西南醫(yī)科大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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