【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物標志物的檢測，具體涉及一種基于核殼結構上轉換納米粒子檢測microrna的方法。
技術介紹
1、microrna是一類重要的內源性非編碼rna，在控制基因表達、細胞分化和細胞凋亡中發揮重要作用。最近的研究表明，microrna的異常表達水平與包括癌癥在內的多種疾病相關。因此，microrna已被用作早期疾病診斷和預后的前瞻性生物標志物。靈敏、特異性地測定microrna不僅有助于了解這些疾病的發病機制，而且可以提高臨床診斷和預后的準確性。由于大多數microrna體積小、在生物樣品中豐度低及家族成員之間的序列同源性，傳統microrna的檢測方法存在靈敏度低、耗時長、易受環境影響和設備要求高等缺點。因此，探索一種簡便、快速、靈敏、準確、特異性地檢測microrna的新方法日益迫切。
技術實現思路
1、本專利技術針對目前檢測microrna方法存在靈敏度低、耗時長、易受環境影響和設備要求高等缺點，提供了一種基于核殼結構上轉換納米粒子檢測microrna的方法。所述檢測方法是先通過振蕩孵育將捕獲探針h1化學鍵合到檸檬酸鈉修飾核殼結構上轉換納米粒子上，制備捕獲探針h1修飾核殼結構上轉換納米粒子緩沖液，再將上述緩沖液與microrna和催化探針h2通過振蕩孵育制備檢測溶液，最后，分別在514nm和980nm激光作用下測試檢測溶液在566nm和654nm處的熒光強度，繪制“熒光猝滅效率-microrna濃度”和“熒光恢復效率-microrna濃度”標準工作曲線，建立線性工作
2、為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、一種基于核殼結構上轉換納米粒子檢測microrna的方法是先通過振蕩孵育將捕獲探針h1化學鍵合到檸檬酸鈉修飾核殼結構上轉換納米粒子上，制備捕獲探針h1修飾核殼結構上轉換納米粒子緩沖液，再將上述緩沖液與microrna和催化探針h2通過振蕩孵育制備檢測溶液，最后，分別在514nm和980nm激光作用下測試檢測溶液在566nm和654nm處的熒光強度，繪制“熒光猝滅效率-microrna濃度”和“熒光恢復效率-microrna濃度”標準工作曲線，建立線性工作方程；具體包括以下步驟：
4、(1)先將150～250μl濃度為0.1mg/ml檸檬酸鈉修飾核殼結構上轉換納米粒子去離子水分散液加入到1.5～3ml?mes緩沖液中，于室溫磁力攪拌30～60min，再加入10～30mg重量比為1:2的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基丁二酰亞胺混合物，于室溫繼續磁力攪拌30～60min，最后加入10～60μl濃度為15mg/l的捕獲探針h1的te緩沖液，于37℃振蕩孵育2～4h，經離心、去離子水洗滌后，分散于500μl?pbs緩沖液中，制備捕獲探針h1修飾核殼結構上轉換納米粒子緩沖液；
5、(2)將10μl不同濃度microrna-222的te緩沖液、20μl?7mg/l催化探針h2的te緩沖液和20μl步驟(1)制備的捕獲探針h1修飾核殼結構上轉換納米粒子緩沖液加入到150μlpbs緩沖液中，于室溫孵育30min，制備檢測溶液；
6、(3)先分別在514nm和980nm激光作用下，測試檢測溶液在566nm和654nm處的熒光強度，再以microrna-222的濃度為橫坐標，分別以566nm處的熒光猝滅效率和654nm處的熒光恢復效率為縱坐標，繪制“熒光猝滅效率-microrna-222濃度”和“熒光恢復效率-microrna濃度-222”的標準工作曲線，建立線性工作方程。
7、進一步地，所述檸檬酸鈉修飾核殼結構上轉換納米粒子是根據文獻(李寶銘,林瑩瑩,邢益鋒,呂海霞；基于核殼結構上轉換納米粒子檢測叔丁基對苯二酚的方法,中國專利技術專利,申請號:202111395473.2,2023-03-17)制備而成；納米粒子的核為鋰銩共摻雜四氟鉺鈉，其中，鉺和鋰元素的摩爾比為85～95:5～15，鉺和銩元素的摩爾比為98～99:1～2；納米粒子的殼為鐿摻雜四氟軋鈉，其中，釓和鐿元素的摩爾比為70～90:10～30。
8、進一步地，所述mes緩沖液為ph值為6的10mmol/l的2-(n-嗎啉)乙磺酸水溶液。
9、進一步地，所述te緩沖液為ph值為8的三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸混合水溶液，其中，三羥甲基氨基甲烷的濃度為10mmol/l，乙二胺四乙酸的濃度為1mmol/l。
10、進一步地，步驟(2)所述microrna-222緩沖液的濃度分別為0nmol/l、0.5nmol/l、1.5nmol/l、2.5nmol/l、3.5nmol/l、4.5nmol/l。
11、與現有技術相比，本專利技術的顯著優點在于：
12、(1)本專利技術所述檢測microrna的方法是以熒光光譜儀為主要檢測設備，重復性好、響應速度快、儀器裝置簡單、便于操作，以去離子水作為溶劑，溶劑綠色安全且樣品無需復雜的預處理。
13、(2)本專利技術所述microrna的熒光檢測方法是以核殼結構上轉換納米粒子作為能量供體，以近紅外光作為激發光源誘導上轉換納米粒子發射熒光，可以顯著降低檢測的熒光背景，提高檢測的靈敏度，以黑洞猝滅劑-2為能量受體，具有背景熒光較低，信噪比高，靈敏度高，猝滅效果優良等優勢。
14、(3)本專利技術所述目標檢測物microrna可以被當作是多個h1/h2雙鏈組裝的催化劑，每一次循環放大反應，將使得654nm處的紅光恢復，566nm處的綠光猝滅，因此可以起到增強microrna檢測信號強度的作用。此外，通過雙色檢測信號可以避免假陽性信號，提高測量精度。
15、(4)本專利技術所述檢測方法能夠實現對血清樣品中microrna-222的檢測，且具有快速、檢測限低、靈敏度高等優勢。在566nm處，熒光猝滅效率與microrna-222在0.5～4.5nmol/l濃度范圍呈線性關系，線性相關系數為0.9847～0.9941，檢測限為6.3～8.7pmol/l，在654nm處，熒光恢復效率與microrna-222在0.5～4.5nmol/l濃度范圍呈線性關系，線性相關系數為0.9754～0.9886，檢測限為4.6～6.1pmol/l；在低豐度生物標志物檢測領域具有廣泛的應用前景。
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1.一種基于核殼結構上轉換納米粒子檢測microRNA的方法，其特征在于：所述檢測方法是先通過振蕩孵育將捕獲探針H1化學鍵合到檸檬酸鈉修飾核殼結構上轉換納米粒子上，制備捕獲探針H1修飾核殼結構上轉換納米粒子緩沖液，再將上述緩沖液與microRNA和催化探針H2通過振蕩孵育制備檢測溶液，最后，分別在514nm和980nm激光作用下測試檢測溶液在566nm和654nm處的熒光強度，繪制“熒光猝滅效率-microRNA濃度”和“熒光恢復效率-microRNA濃度”標準工作曲線，建立線性工作方程；具體包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述檸檬酸鈉修飾核殼結構上轉換納米粒子的核為鋰銩共摻雜四氟鉺鈉，其中，鉺和鋰元素的摩爾比為85～95:5～15，鉺和銩元素的摩爾比為98～99:1～2；納米粒子的殼為鐿摻雜四氟軋鈉，其中，釓和鐿元素的摩爾比為70～90:10～30。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述MES緩沖液為pH值為6的10mmol/L的2-(N-嗎啉)乙磺酸水溶液。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)所述microRNA-222緩沖液的濃度分別為0nmol/L、0.5nmol/L、1.5nmol/L、2.5nmol/L、3.5nmol/L、4.5nmol/L。
...【技術特征摘要】
1.一種基于核殼結構上轉換納米粒子檢測microrna的方法，其特征在于：所述檢測方法是先通過振蕩孵育將捕獲探針h1化學鍵合到檸檬酸鈉修飾核殼結構上轉換納米粒子上，制備捕獲探針h1修飾核殼結構上轉換納米粒子緩沖液，再將上述緩沖液與microrna和催化探針h2通過振蕩孵育制備檢測溶液，最后，分別在514nm和980nm激光作用下測試檢測溶液在566nm和654nm處的熒光強度，繪制“熒光猝滅效率-microrna濃度”和“熒光恢復效率-microrna濃度”標準工作曲線，建立線性工作方程；具體包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述檸檬酸鈉修飾核殼結構上轉換納米粒子的核為鋰銩共摻雜四氟鉺鈉，其中，鉺和鋰元素的摩爾比為85～95:5～15，鉺和銩...
【專利技術屬性】
技術研發人員：笪琳萃，鄭備紅，孫艷，李寶銘，呂海霞，
申請(專利權)人：福建省婦幼保健院，
類型：發明
國別省市：
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