【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種呼吸道合胞病毒f蛋白突變體及其在制備呼吸道合胞病毒疫苗中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、呼吸道合胞病毒(respiratory?syncytial?virus)是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒下呼吸道嚴重感染的重要病原體之一。據(jù)統(tǒng)計，全球5歲以下兒童感染rsv人數(shù)高達3400萬，由于rsv感染后無法獲得持續(xù)免疫，可出現(xiàn)反復(fù)感染，幾乎100％的嬰幼兒在2歲以內(nèi)感染過1次以上，并導(dǎo)致66000-199000例死亡。在1月至1歲兒童全因死亡的單病原感染因素分析中，rsv感染引起1歲以下患兒病死率高達6.7%，僅次于瘧疾，在全球范圍內(nèi)造成嚴重的疾病負擔(dān)。除嬰幼兒外，免疫功能低下的成年及老年人也是rsv感染的高危人群。每年有3%~10%的成年人感冒由?rsv引起，老年人群中rsv感染引起的疾病負擔(dān)與非流行季節(jié)感冒引起的疾病負擔(dān)相當。感染rsv后會導(dǎo)致黏液分泌增加及發(fā)炎，引起心臟衰竭和繼發(fā)性細菌性肺炎等多種嚴重的并發(fā)癥。rsv也是一種重要的醫(yī)源性感染病原，特別是對早產(chǎn)兒、先天性心臟病、支氣管肺發(fā)育不良的嬰兒及所有免疫功能抑制的病人具有很大的危害，對人類健康、全球醫(yī)療及經(jīng)濟影響巨大。因此，who將rsv疫苗列為二十一世紀全球應(yīng)優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一，研發(fā)安全且有效的rsv疫苗是當前的迫切需求。
2、rsv屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，為單股負鏈rna病毒。其基因組全長15.2kb，轉(zhuǎn)錄十個基因組，共編碼包括3個跨膜蛋白?(g、f和sh)、2個基質(zhì)蛋白?(m和m2)、3個核衣殼蛋白(n、p和l)及2個非結(jié)構(gòu)蛋白(ns1
3、rsv的f蛋白是中和抗體的主要靶標蛋白，屬于i型整合膜蛋白，其前體蛋白f0由574個氨基酸組成，三個f0之間通過疏水作用形成三聚體。在病毒入侵介導(dǎo)膜融合過程中，前體f0會被furin蛋白酶切割并釋放出一個含有27個氨基酸的短肽p27(109~127aa)，其余兩段f2及f1通過兩個二硫鍵連接形成成熟的f蛋白，通過出芽的方式展示到細胞膜或病毒體表面。此時的f蛋白處于高能級亞穩(wěn)態(tài)，十分不穩(wěn)定，被稱為pre-f。感染細胞后會自發(fā)變成低能態(tài)的融合后構(gòu)象post-f。大量臨床前及臨床數(shù)據(jù)表明高中和活性的位點主要存在于融合前構(gòu)象，以rsv?f融合前構(gòu)象為抗原的疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生更高水平的病毒中和抗體。雖然以pre-f為基礎(chǔ)的?rsv疫苗展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但維持f蛋白融合前構(gòu)象也成為疫苗研發(fā)的重難點。目前為止，全球僅有g(shù)sk和輝瑞兩款針對rsv?f蛋白的重組蛋白類疫苗獲批上市，兩個產(chǎn)品都采用了f蛋白融合前構(gòu)象，且均用于美國60歲及以上群體，但國內(nèi)尚無任何相關(guān)預(yù)防性疫苗類產(chǎn)品上市。
4、因此開發(fā)一種安全性好、表達量高且穩(wěn)定的融合前構(gòu)象f蛋白抗原成為本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的技術(shù)問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，本專利技術(shù)開發(fā)了一種呼吸道合胞病毒融合前f蛋白突變體，該突變體蛋白能夠具有穩(wěn)定的融合前構(gòu)象和高表達量，可形成穩(wěn)定的三聚體，從而可用于rsv感染的治療。2013年，mclellan團隊等人首次通過點突變的方式開發(fā)了第一個獲得穩(wěn)固的融合前構(gòu)象f蛋白“ds-cav1”：通過在f1片段內(nèi)s155c和s290c點突變獲得分子內(nèi)二硫鍵，同時加入s190f和v207l點突變以增強關(guān)鍵中和表位的結(jié)合活性(doi:10.1126/science.1243283)，該蛋白被證實可以激發(fā)顯著更高水平的中和抗體滴度。目前以結(jié)構(gòu)生物學(xué)為基礎(chǔ)開發(fā)的穩(wěn)定融合前構(gòu)象f蛋白疫苗也已進入臨床階段。因此本專利技術(shù)所述重組rsvf蛋白在ds_cav1（稱為野生型）的氨基酸序列基礎(chǔ)上引入突變，所述突變包括氨基酸的替換、缺失和插入。
2、本專利技術(shù)的第一方面提供一種呼吸道合胞病毒f蛋白，所述f蛋白包含至少一種選自以下組的突變：
3、(a)至少一對氨基酸殘基被半胱氨酸取代；
4、(b)f蛋白信號肽部分被人免疫球蛋白輕鏈信號肽替代；
5、(c)至少兩個多堿基序列的位點被替換。
6、在一些實施方式中，所述f蛋白包括f蛋白多肽的f1亞基和/或f2亞基中的至少一對氨基酸殘基被半胱氨酸取代。
7、在一些實施方式中，所述半胱氨酸取代使得所述f蛋白的f1亞基和f2亞基之間形成非天然二硫鍵連接，所述非天然二硫鍵包括除f1亞基和f2亞基之間形成的cys69-cys212和cys37-cys439之外的二硫鍵。
8、在rsv?f蛋白融合前構(gòu)象中，β2與β4鏈之間彼此靠近，促進0表位兩個不連續(xù)表位的空間折疊；通過添加非天然二硫鍵可以相對穩(wěn)定β2與β4鏈之間空間位置，以增強融合前f1亞基和f2亞基之間的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，阻止七肽重復(fù)區(qū)hra和hrb區(qū)域構(gòu)象變化，很好的穩(wěn)定pre-f蛋白結(jié)構(gòu)，同時維持或增強0表位和v表位等重要位點的結(jié)合活性，提高突變抗原的融合前f蛋白特異性免疫原性。
9、在一些實施方式中，所述f蛋白包括102c+147c，102c+149c，102c+150c，101c+147c，101c+146c，100c+145c中的至少一對半胱氨酸突變，突變位點參考如seq?id?no:01所示的野生型呼吸道合胞病毒f蛋白氨基酸序列的位點。
10、在一些實施方式中，被人免疫球蛋白輕鏈信號肽取代的所述f蛋白信號肽部分至少包括seq?id?no:1所示序列的第1~25位氨基酸殘基。
11、在一些實施方式中，所述人免疫球蛋白輕鏈信號肽如seq?id?no:2所示。
12、野生型f蛋白首先形成f0前體蛋白，經(jīng)弗林蛋白酶切割后釋放出一個由27個氨基酸組成的多肽pep27，其余兩段f2和f1通過兩個二硫鍵連接形成成熟的f蛋白-pre-f，通過出芽的方式展示到細胞膜或病毒體表面。
13、在一些實施方式中，為了提高f蛋白內(nèi)部p27多肽的移除效率，f蛋白上的兩個多堿基位點被替換。
14、在一些實施方式中，所述f蛋白內(nèi)部的p27多肽至少包括野生型呼吸道合胞病毒f蛋白的110~136位氨基酸殘基。
15、在一些實施方式中，與如seq?id?no:1所示的野生型呼吸道合胞病毒f蛋白氨基酸序列相比，所述f蛋白的多堿基序列rarr和kkrkrr中107位丙氨酸a突變?yōu)榫彼醨，134位賴氨酸k突變?yōu)榫彼醨。
16、在一些實施方式中，所述f蛋白包括半胱氨酸突變102c+147c，所述f蛋白信號肽部分被如本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述F蛋白包含至少一種選自以下組的突變：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述F蛋白包括F蛋白多肽的F1亞基和/或F2亞基中的至少一對氨基酸殘基被半胱氨酸取代。
3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述F蛋白包括102C+147C，102C+149C，102C+150C，101C+147C，101C+146C，100C+145C中的至少一對半胱氨酸突變，突變位點參考如SEQ?ID?NO:01所示的野生型呼吸道合胞病毒F蛋白氨基酸序列的位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，被人免疫球蛋白輕鏈信號肽取代的所述F蛋白信號肽部分至少包括SEQ?ID?NO:1所示序列的第1~25位氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白輕鏈信號肽如SEQ?ID?NO:2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，與如SEQ?ID?NO:1所示的野生型呼吸道合胞
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，其特征在于，所述F蛋白包括選自SEQ?ID?NO:3-8任一所示的氨基酸序列。
8.一種重組核酸，包括編碼如權(quán)利要求1-7任一項所述的呼吸道合胞病毒F蛋白的核苷酸序列。
9.一種表達載體，包括權(quán)利要求8所述的重組核酸。
10.一種宿主細胞，包括如權(quán)利要求8所述的重組核酸或權(quán)利要求9所述的表達載體。
11.如權(quán)利要求10所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞選自大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
12.一種制備如權(quán)利要求1-7任一項所述的呼吸道合胞病毒F蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
13.如權(quán)利要求1-7任一項所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，或如權(quán)利要求12所述的制備方法制備得到的呼吸道合胞病毒F蛋白在制備預(yù)防呼吸道合胞病毒感染疫苗中的應(yīng)用。
14.一種預(yù)防呼吸道合胞病毒感染的疫苗，包括如權(quán)利要求1-7任一項所述的呼吸道合胞病毒F蛋白，或如權(quán)利要求12所述的制備方法制備得到的呼吸道合胞病毒F蛋白，和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
15.如權(quán)利要求14所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗進一步包括佐劑，所述佐劑包括鋁佐劑、角鯊烯、生育酚、MPL、LPA、CpG以及QS-21中的至少一種。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種呼吸道合胞病毒f蛋白，其特征在于，所述f蛋白包含至少一種選自以下組的突變：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒f蛋白，其特征在于，所述f蛋白包括f蛋白多肽的f1亞基和/或f2亞基中的至少一對氨基酸殘基被半胱氨酸取代。
3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的呼吸道合胞病毒f蛋白，其特征在于，所述f蛋白包括102c+147c，102c+149c，102c+150c，101c+147c，101c+146c，100c+145c中的至少一對半胱氨酸突變，突變位點參考如seq?id?no:01所示的野生型呼吸道合胞病毒f蛋白氨基酸序列的位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒f蛋白，其特征在于，被人免疫球蛋白輕鏈信號肽取代的所述f蛋白信號肽部分至少包括seq?id?no:1所示序列的第1~25位氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呼吸道合胞病毒f蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白輕鏈信號肽如seq?id?no:2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒f蛋白，其特征在于，與如seq?id?no:1所示的野生型呼吸道合胞病毒f蛋白氨基酸序列相比，所述f蛋白的多堿基序列rarr和kkrkrr中107位丙氨酸a突變?yōu)榫彼醨，134位賴氨酸k突變?yōu)榫彼醨，
7.根據(jù)權(quán)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：董文娜，王海龍，劉曉滿，徐又農(nóng)，王齊，付麗麗，
申請(專利權(quán))人：北京華諾泰生物醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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