【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生命科學(xué)、生物技術(shù)和腫瘤免疫基因治療領(lǐng)域，涉及一種重組溶瘤腺病毒載體及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及一種表達人il-2、4-1bbl和膜型il-21蛋白的重組溶瘤腺病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、腫瘤是威脅人類健康的重大疾病之一。在我國已成為疾病死因之首，且發(fā)病率和死亡率仍在不斷攀升。隨著腫瘤生物學(xué)研究的不斷深入，腫瘤診治水平有了明顯提高，但是腫瘤治療后的高轉(zhuǎn)移及高復(fù)發(fā)仍是腫瘤臨床治療中一個急待解決的問題。因此，尋找新的治療手段勢在必行。近年來，腫瘤免疫治療取得了突破性進展，如嵌合抗原受體t細胞技術(shù)(car-t)、免疫檢查點阻斷劑等在治療某些腫瘤均取得顯著療效，而在大多數(shù)腫瘤中并未顯示明顯優(yōu)勢因此尋求不同治療方法包括不同免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用是今后腫瘤治療領(lǐng)域的一個重點方向。
2、自然殺傷(natural?killer，nk)細胞作為機體天然免疫最為主要的細胞，在抗腫瘤方面具有較多的潛在優(yōu)勢。充分發(fā)揮和利用好nk細胞的抗腫瘤效應(yīng)是免疫治療抗腫瘤的強有力手段之一。目前臨床上通過過繼回輸體外擴增的nk細胞以增強抗腫瘤免疫。然而，回輸?shù)膎k細胞在實體瘤內(nèi)的浸潤數(shù)量有限，且浸潤的nk細胞功能失活。因此，增加腫瘤內(nèi)nk細胞的浸潤及其功能活性對于腫瘤治療具有重要意義。
3、溶瘤腺病毒(oncolytic?adenovirus，oa)或稱條件復(fù)制型腺病毒(conditionallyreplicating?adenovirus，cra)，是由腺病毒改造成而成，最常用的方法是通過某種腫瘤特異性啟動子調(diào)控
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于提供一種可以高效表達il-2、4-1bbl和膜型il-21重組溶瘤腺病毒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，對溶瘤腺病毒進行進一步的改造，以增加腫瘤微環(huán)境中nk細胞的數(shù)量和活性，增強其抗腫瘤免疫。
2、為了實現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供了以下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了一種表達人il-2、4-1bbl和膜型il-21蛋白的重組溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法，其中，所述構(gòu)建方法包括：步驟1、在腺病毒的e1區(qū)插入兩個表達盒，分別是人巨細胞病毒廣譜增強子/啟動子調(diào)控的il-2、4-1bbl和膜型il-21基因的表達盒，以及腫瘤組織或細胞特異性的端粒酶啟動子調(diào)控的e1基因的表達盒；步驟2、將步驟1構(gòu)建的含有e1a基因以及il-2、4-1bbl和膜型il-21基因的雙表達盒穿梭質(zhì)粒，與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hek?293細胞，獲得共表達il-2、4-1bbl和膜型il-21的重組溶瘤腺病毒載體。
4、進一步地，所述的il-2、4-1bbl和膜型il-21基因，通過以下任意一種方式連接：病毒2a肽或內(nèi)部核酸進入位點。
5、進一步地，所述的il-2、4-1bbl和膜型il-21的表達基因通過若干2a肽序列串聯(lián)形成一個開放讀框。
6、進一步地，步驟1所述的腺病毒包含：5型、2型、3型、7型11型、35型和5/f35型腺病毒中的任意一種或多種。
7、進一步地，步驟1所述的腫瘤組織或細胞特異性的端粒酶啟動子，包含：端粒酶啟動子、甲胎蛋白啟動子、前列腺特異抗原啟動子、轉(zhuǎn)錄因子e2f-1啟動子、存活素啟動子、缺氧誘導(dǎo)因子-1啟動子、巢蛋白啟動子、癌胚抗原啟動子、p53啟動子和mucin?1啟動子中的任意一種或多種。
8、本專利技術(shù)還提供了一種采用上述的方法構(gòu)建獲得的表達il-2、4-1bbl和膜型il-21的重組溶瘤腺病毒載體。
9、本專利技術(shù)也提供了一種上述的表達il-2、4-1bbl和膜型il-21的重組溶瘤腺病毒載體的應(yīng)用，其中，所述的重組溶瘤腺病毒載體用于制備治療癌癥的藥物或免疫佐劑。
10、進一步地，所述的癌癥包含：肺癌、肝癌、膽管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、惡性膠質(zhì)瘤、頭頸部惡性腫瘤、各類惡性肉瘤。
11、進一步地，所述的溶瘤腺病毒，通過選擇性地在端粒酶陽性腫瘤細胞的復(fù)制直接溶解腫瘤細胞而活化抗腫瘤活性。
12、進一步地，所述的溶瘤腺病毒，在腫瘤內(nèi)注射后，腺病毒載體本身作為免疫佐劑，并協(xié)同溶瘤腺病毒表達其編碼的il-2、膜型il-21和4-1bbl基因產(chǎn)物，通過吸引、趨化和擴增腫瘤內(nèi)微環(huán)境中的自然殺傷細胞而發(fā)揮抗腫瘤活性。
13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有如下有益效果：
14、本專利技術(shù)提供了一種可以高效表達il-2、4-1bbl和膜型il-21重組溶瘤腺病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，該構(gòu)建方法通過攜帶有兩個表達盒質(zhì)粒載體，將表達il-2、4-1bbl和膜型il-21的編碼序列插入該穿梭質(zhì)粒中，獲得可以高效表達il-2、4-1bbl和膜型il-21重組溶瘤腺病毒載體。通過瘤內(nèi)注射該重組溶瘤腺病毒載體，一方面裂解腫瘤細胞，另一方面高效表達的il-2、4-1bbl和膜型il-21，可有效增加腫瘤微環(huán)境中自然殺傷(nk)細胞的浸潤和活性，改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境，增強其抗腫瘤活性。因此，本專利技術(shù)適用于各種實體腫瘤的治療藥物或免疫佐劑的制備。
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1.一種表達人IL-2、4-1BBL和膜型IL-21蛋白的重組溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的IL-2、4-1BBL和膜型IL-21基因，通過以下任意一種方式連接：病毒2A肽或內(nèi)部核酸進入位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的IL-2、4-1BBL和膜型IL-21的表達基因通過若干2A肽序列串聯(lián)形成一個開放讀框。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1所述的腺病毒包含：5型、2型、3型、7型11型、35型和5/F35型腺病毒中的任意一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1所述的腫瘤組織或細胞特異性的端粒酶啟動子，包含：端粒酶啟動子、甲胎蛋白啟動子、前列腺特異抗原啟動子、轉(zhuǎn)錄因子E2F-1啟動子、存活素啟動子、缺氧誘導(dǎo)因子-1啟動子、巢蛋白啟動子、癌胚抗原啟動子、p53啟動子和Mucin?1啟動子中的任意一種或多種。
6.一種采用如權(quán)利要求1～5中任意一項所述的方法構(gòu)建獲得的表達IL-
7.一種如權(quán)利要求6所述的表達IL-2、4-1BBL和膜型IL-21的重組溶瘤腺病毒載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的重組溶瘤腺病毒載體用于制備治療癌癥的藥物或免疫佐劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組溶瘤腺病毒載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的癌癥包含：肺癌、肝癌、膽管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、惡性膠質(zhì)瘤、頭頸部惡性腫瘤、各類惡性肉瘤。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組溶瘤腺病毒載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的溶瘤腺病毒，通過選擇性地在端粒酶陽性腫瘤細胞的復(fù)制直接溶解腫瘤細胞而活化抗腫瘤活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組溶瘤腺病毒載體的應(yīng)用，其特征在于，所述的溶瘤腺病毒，在腫瘤內(nèi)注射后，腺病毒載體本身作為免疫佐劑，并協(xié)同溶瘤腺病毒表達其編碼的IL-2、膜型IL-21和4-1BBL基因產(chǎn)物，通過吸引、趨化和擴增腫瘤內(nèi)微環(huán)境中的自然殺傷細胞而發(fā)揮抗腫瘤活性。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種表達人il-2、4-1bbl和膜型il-21蛋白的重組溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的il-2、4-1bbl和膜型il-21基因，通過以下任意一種方式連接：病毒2a肽或內(nèi)部核酸進入位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的il-2、4-1bbl和膜型il-21的表達基因通過若干2a肽序列串聯(lián)形成一個開放讀框。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1所述的腺病毒包含：5型、2型、3型、7型11型、35型和5/f35型腺病毒中的任意一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1所述的腫瘤組織或細胞特異性的端粒酶啟動子，包含：端粒酶啟動子、甲胎蛋白啟動子、前列腺特異抗原啟動子、轉(zhuǎn)錄因子e2f-1啟動子、存活素啟動子、缺氧誘導(dǎo)因子-1啟動子、巢蛋白啟動子、癌胚抗原啟動子、p53啟動子和mucin?1啟動子中的任意一種或多種。
6.一種采用如權(quán)利要求1～5中...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：譚曉華，荀敬，廖啟彬，范忠義，李寧，
申請(專利權(quán))人：深圳市第三人民醫(yī)院深圳市肝病研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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