【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物學和醫學領域，更具體地涉及一種基于滋養層細胞置換的重構囊胚的制備與應用。
技術介紹
1、體細胞核轉移(scnt)技術已廣泛應用于克隆哺乳動物物種，包括綿羊(wilmut?etal.,1997)、牛(kato?et?al.,1998)、老鼠(wakayama?et?al.，1998)、豬(polejaeva?etal.,2000)、山羊(baguisi?et?al.,1999)、兔子(chesnéet?al.,2002)和狗(lee?et?al.,2005)。最近，通過優化體細胞核轉移協議和應用表觀遺傳調控因子(包括組蛋白去甲基化酶kdm4d和組蛋白去乙酰化抑制劑trichostatin?a(tsa))，利用scnt克隆了野生型和基因編輯的食蟹猴(macaca?fascicularis)，活產率分別為1.5％和2.5％(liu等人，2019b；liuet?al.,2018)。然而，這種克隆效率遠遠低于本專利技術人之前報道的正常受精卵非人靈長類(nhp)胚胎(27.6％)(sun?et?al.,2008)。
2、傳統上，幾乎所有克隆的哺乳動物物種都表現出極低的出生率，大多數物種的出生率為1-3％，牛的出生率為5-20％(rodriguez-osorio?et?al.,2012；yang等人，2007)。與如此低的存活率相一致的是，體細胞克隆動物的胚胎發育異常，尤其是在胚胎外譜系中被報道(yang?et?al.,2007)。仔豬scnt胎盤的絨毛密度和絨毛外細胞滋養層厚度遠低于人工授精胎盤(ao?et?a
3、另一方面，胚胎缺陷在克隆動物中也很常見。在scnt衍生的牛和小鼠中觀察到出生體重超標或大齡后代綜合征(c.l.keefer等人，1994；j.m.wilson等人，1995；s.m.willadsen等人，1991；wakayama等人，2006；yang等人，2007)。其他癥狀，如出生體重低、呼吸系統功能障礙和異常的器官發育也是scnt胎兒的常見異常(ao等，2017；yang等人，2007)。有趣的是，當結合四倍體互補時，通過小鼠scnt胚胎干細胞獲得的的活產率遠高于單獨的scnt胚胎(20～30％vs.1～2％)，這表明克隆胚胎的滋養外胚層缺陷是胚胎發育失敗的主要原因(wakayama?et?al.,2006；yang等人，2007)。
4、之前的研究證明了內細胞團(icm)或滋養層交換(te)技術獲得活產的可行性(loiet?al.,2018)，盡管這種方法未能提高牛的克隆效率(murakami?et?al.,2006)。
5、綜上，本領域目前急需能顯著提升克隆胚胎發育成功率的方法與產品。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種基于滋養層細胞置換的重構囊胚的制備與應用。
2、本專利技術第一方面提供一種囊胚期胚胎滋養層細胞的制備方法，包括以下步驟：
3、(a)提供第一胚胎，所述第一胚胎為處于囊胚期的非人靈長類動物胚胎，對所述第一胚胎的透明帶激光打孔，打孔的位置為所述第一胚胎的內細胞團(inner?cell?mass,icm)所在位置，從而獲得經激光打孔處理的第一胚胎；
4、(b)培養所述第一胚胎，其內細胞團會由所述激光打孔位置自行排出，從而獲得腔內不含內細胞團的第一胚胎空囊胚；
5、(c)提供分離自第二胚胎的內細胞團，所述第二胚胎為處于囊胚期的非人靈長類動物胚胎，將所述分離自第二胚胎的內細胞團導入步驟(b)所獲得的腔內不含內細胞團的第一胚胎空囊胚中；其中，在所述導入步驟之前、之中、或之后，將所述第一胚胎的內細胞團從所述空囊胚上分離、移除；從而獲得重構的囊胚；
6、在另一優選例中，所述所有步驟的所有顯微操作均在帶有加熱臺的顯微操作系統中進行。
7、在另一優選例中，所述胚胎為非人靈長動物的胚胎。
8、在另一優選例中，所述胚胎為存活狀態的胚胎。
9、在另一優選例中，在步驟(a)中，所述第一胚胎處于囊胚中晚期。
10、在另一優選例中，在步驟(a)中，所述第二胚胎處于囊胚中晚期。
11、在另一優選例中，在步驟(b)中，所獲得的腔內不含內細胞團的第一胚胎空囊胚，可以為帶有外排的所述第一胚胎的內細胞團，也可以為外排的所述第一胚胎的內細胞團已被分離、移除。
12、在另一優選例中，所述方法還包括，將所述重構的囊胚再生成非人哺乳動物。
13、在另一優選例中，所述胚胎為通過向成熟卵母細胞進行單精子胞漿注射獲得的胚胎。
14、在另一優選例中，所述胚胎為通過向卵母細胞進行核移植獲得的克隆的胚胎。
15、在另一優選例中，步驟(a)中所述激光的參數為power：100％，pulse：100～200μs，并且可在打孔位置多次打孔以確保所述透明帶的破裂。
16、在另一優選例中，步驟(b)中所述繼續培養的時間為4至8小時，更佳地，5至7小時，最佳地，6小時。
17、在另一優選例中，步驟(c)中分離、獲得所述第二胚胎的內細胞團，發生在步驟(b)中所述的激光打孔后的4至5小時、步驟(c)中所述的滋養層細胞置換前的1至2小時。
18、在另一優選例中，步驟(c)中分離、獲得所述第二胚胎的內細胞團的，是通過常規的免疫外科法實現的。
19、在另一優選例中，所述免疫外科法包括抗體孵育0.5小時，補體孵育0.5小時，共計約1小時。
20、在另一優選例中，步驟(c)還包括：在分離獲得所述第二胚胎的內細胞團后，使用新鮮的培養基清洗所述內細胞團。
21、在另一優選例中，步驟(c)所述的將所述第二胚胎的內細胞團注射入步驟(b)所獲得的腔內不含內細胞團的第一胚胎空囊胚中，包括步驟：
22、(c1)將所述第二胚胎的內細胞團與步驟(b)所獲得的腔內不含內細胞團的第一胚胎空囊胚共同放在顯微操作臺上；
23、(c2)在視野下，左側用直徑約為120μm的持卵針將步驟(b)所獲得的腔內不含內細胞團的第一胚胎空囊胚固定在視野下，調整其方向，盡可能避免使孵育出來的、仍粘連在步驟(b)所獲得的腔內不含內細胞團的第一胚胎空囊胚的外側的所述第一胚胎的內細胞團朝向視野的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種囊胚期胚胎滋養層細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述所有步驟的所有顯微操作均在帶有加熱臺的顯微操作系統中進行。
3.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述胚胎為非人靈長動物的胚胎。
4.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述胚胎為存活狀態的胚胎。
5.如權利要求1所述方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述第一胚胎處于囊胚中晚期。
6.如權利要求1所述方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述第二胚胎處于囊胚中晚期。
7.如權利要求1所述方法，其特征在于，在步驟(b)中，所獲得的腔內不含內細胞團的第一胚胎空囊胚，可以為帶有外排的所述第一胚胎的內細胞團，也可以為外排的所述第一胚胎的內細胞團已被分離、移除。
8.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述方法還包括，將所述重構的囊胚再生成非人哺乳動物。
9.一種重構的囊胚，其特征在于，所述重構的囊胚是以如權利要求1所述的方法制備的。
10.如權利要求2所述重構的囊胚，其特征在于，所
...【技術特征摘要】
1.一種囊胚期胚胎滋養層細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述所有步驟的所有顯微操作均在帶有加熱臺的顯微操作系統中進行。
3.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述胚胎為非人靈長動物的胚胎。
4.如權利要求1所述方法，其特征在于，所述胚胎為存活狀態的胚胎。
5.如權利要求1所述方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述第一胚胎處于囊胚中晚期。
6.如權利要求1所述方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述第二胚胎處于囊胚中晚期...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫強，廖兆蒂，劉真，
申請(專利權)人：中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心，
類型：發明
國別省市：
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