【技術實現步驟摘要】
本申請涉及抗菌肽的，尤其是涉及一種乳酸鏈球菌素的生產方法和應用。
技術介紹
1、乳酸鏈球菌素又稱為乳鏈菌肽(nisin)，是由牛奶和奶酪中天然存在的乳酸鏈球菌發酵產生的一種天然生物抗菌肽，具有廣譜抗菌作用，能有效抑制大部分革蘭陽性菌及其芽孢的生長和繁殖，是一種世界公認的高效、無毒、安全、無副作用的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑。
2、乳酸鏈球菌產nisin的能力普遍較低，要達到工業化生產應用需通過誘變，篩選以及發酵(還包括高產菌株篩選)等一系列過程，才能得到一株高產且穩定的菌株。目前篩選高產菌株最常用的方法是瓊脂擴散法，以黃色微球菌為檢測菌，通過抑菌圈的直徑大小來反映效價，該方法的優點是直觀地以應用效果來表示樣品的效價高低，同時該檢測方法的弊端也相當明顯，檢測菌需要培養16小時以上才能觀察到清晰的抑菌圈從而得出結果，在工業生產上不能快速反饋以便及時調整工藝條件，這一耗時較大的檢測方法導致了高產菌株的篩選不便，從而導致乳酸鏈球菌素的生產效率低下，成為乳酸鏈球菌素育種工作中較為棘手的問題。
技術實現思路
1、為了解決上述技術問題，本申請提供一種乳酸鏈球菌素的生產方法和應用。
2、第一方面，本申請提供的一種乳酸鏈球菌素的生產方法，包括以下步驟：誘變，篩選以及發酵，所述篩選的具體操作為：將誘變后得到的誘變菌懸液經過初篩，復篩后得到大抑菌圈的單菌落，將其置于ph＝5.5-6.5的環境下發酵，發酵開始16-18h后檢測效價，篩出高產菌株，其中，檢測效價所用方法為電導率法或
3、具體地講，所述誘變的具體操作為：將出發菌株采用生理鹽水稀釋100-1000倍得到菌懸液，隨后對菌懸液進行紫外誘變/微波誘變/等離子體誘變中的任一種誘變，得到誘變菌懸液。
4、紫外誘變的具體操作為：在照射距離為30cm、紫外線照射功率為15w的條件下對菌懸液進行時長為2.5min的紫外照射，得到誘變菌懸液。
5、微波誘變的具體操作為：將稀釋后的菌懸液置于培養基中，在30℃的溫度下培養至對數生長期，隨后在功率為750w、頻率為2450mhz的條件下微波處理30s，得到誘變菌懸液。
6、等離子體誘變的具體操作為：在氣體流量為10l/min的氦氣環境下，對誘變菌懸液進行作用距離為2mm，功率為120w的等離子射頻處理，處理時長為60s，得到誘變菌懸液。
7、初篩，復篩的具體操作為：將誘變菌懸液涂布于初篩平板上，培養36-48h后觀察菌落形態，選取單菌落接種至復篩平板上，培養36-48h后得到大抑菌圈的單菌落。
8、其中所述電導率法的具體操作為：在發酵至16-18h時，取發酵中的誘變菌懸液稀釋至10-20iu/ml，與黃色微球菌菌懸液一并恒溫搖床培養4-5h，其中稀釋后的發酵中的誘變菌懸液與黃色微球菌菌懸液的體積比為50:2，測定電導率，通過電導率標準曲線比對，得出發酵中的誘變菌懸液中的待測乳酸鏈球菌素的效價；
9、所述電導率標準曲線中的電導率標準溶液采用以下方法得到：稱取乳酸鏈球菌素標準品并用0.02mol/ml的hcl溶解，隨后定容并配制成效價為2000iu/ml的乳酸鏈球菌素標準液，再用0.02mol/ml的hcl將乳酸鏈球菌素標準液進行稀釋，得到效價呈梯度設置的乳酸鏈球菌素標準品溶液。
10、優選的，所述電導率法中的乳酸鏈球菌素標準品溶液中的乳酸鏈球菌素效價設置范圍為10-20iu/ml。
11、在本申請的具體實施方式中，所述電導率法中的乳酸鏈球菌素標準品溶液的效價梯度依次設置為10iu/ml、12iu/ml、14iu/ml、16iu/ml、18iu/ml以及20iu/ml。
12、本申請具體實施方式中標準工作溶液的效價梯度的依次設置只是其中一個例子，而并非全部設計方案，對其余中間濃度點作出適當調整的技術方案同樣在本申請方法的范圍內。
13、所述黃色微球菌菌懸液采用以下方法得到：將黃色微球菌接種至lb平板上，于30℃的溫度下恒溫培養48h，隨后選取單菌落接入lb液體培養基中，搖床培養20h，得到黃色微球菌濃度為1×108cfu/ml的黃色微球菌菌懸液，分裝后冷藏備用；
14、所述電導率標準曲線采用以下方法得出：將不同效價的電導率標準溶液分別加入lb培養基中，添加量為500ul，隨后分別加入20ul的黃色微球菌菌懸液，搖床培養4h后測定6種不同效價的電導率標準溶液的電導率，將已知的效價與電導率作圖，線性回歸，得到電導率標準曲線。
15、其中所述分光光度法的具體操作為：在發酵至16-18h時，取發酵中的誘變菌懸液稀釋至10-20iu/ml，與黃色微球菌菌懸液一并恒溫搖床培養4-5h，其中稀釋后的發酵中的誘變菌懸液與黃色微球菌菌懸液的體積比為50:2，測定od600，通過分光光度標準曲線比對，
16、得出發酵中的誘變菌懸液中的待測乳酸鏈球菌素的效價；
17、所述分光光度標準曲線中的分光光度標準溶液采用以下方法得到：稱取乳酸鏈球菌素標準品并用0.02mol/ml的hcl溶解，隨后定容并配制成效價為2000iu/ml的乳酸鏈球菌素標準液，再用0.02mol/ml的hcl將乳酸鏈球菌素標準液進行稀釋，得到具有效價梯度的乳酸鏈球菌素標準品溶液；
18、優選的，所述分光光度法中的乳酸鏈球菌素標準品溶液中的乳酸鏈球菌素效價設置范圍為5-20iu/ml。
19、在本申請的具體實施方式中，所述分光光度法中的乳酸鏈球菌素標準品溶液的效價梯度依次設置為5iu/ml、7.5iu/ml、10iu/ml、12.5iu/ml、15iu/ml、17.5iu/ml以及20iu/ml。
20、本申請具體實施方式中標準工作溶液的效價梯度的依次設置只是其中一個例子，而并非全部設計方案，對其余中間濃度點作出適當調整的技術方案同樣在本申請方法的范圍內。
21、所述分光光度標準曲線采用以下方法得出：將不同效價的電導率標準溶液分別加入lb培養基中，添加量為500ul，隨后分別加入20ul的黃色微球菌菌懸液，搖床培養4h后測定乳酸鏈球菌素的od600，將已知的效價與od600作圖，線性回歸，得到分光光度標準曲線。
22、通過采用上述技術方案，本申請首先利用梯度排列的不同效價乳酸鏈球菌素標準溶液與黃色微球菌菌懸液共同搖床培養，隨后測定了搖床培養4h后的乳酸鏈球菌素的od600或是體系中溶液電導率，再與已知的效價對應，作圖，線性回歸，得到電導率標準曲線或是分光光度標準曲線，再采用測定電導率或者測定的od600方式通過標準曲線來計算出發酵中的誘變菌懸液中的待測乳酸鏈球菌素的效價，本申請提供的電導率法與分光光度法具有儀器要求低、重復性好、步驟簡便的優點，并且與現有的瓊脂擴散法相比，本申請提供的兩種檢測方法可大幅提升檢測效率，與瓊脂擴散法得到的檢測結果相比，檢測時間可由原先的16小時縮短至5小時以內，因此本申請的生產方法能夠快速篩選高產菌株，降本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種乳酸鏈球菌素的生產方法，包括以下步驟：誘變，篩選以及發酵，其特征在于：所述篩選的具體操作為：將誘變后得到的誘變菌懸液經過初篩，復篩后得到大抑菌圈的單菌落，將其置于pH=5.5-6.5的環境下發酵，發酵開始16-18h后檢測效價，篩出高產菌株，其中，檢測效價所用方法為電導率法或分光光度法。
2.根據權利要求1所述的一種乳酸鏈球菌素的生產方法，其特征在于：所述電導率法中的乳酸鏈球菌素標準品溶液中的乳酸鏈球菌素效價設置范圍為10-20?IU/mL。
3.根據權利要求1所述的一種乳酸鏈球菌素的生產方法，其特征在于：所述分光光度法中的乳酸鏈球菌素標準品溶液中的乳酸鏈球菌素效價設置范圍為5-20?IU/mL。
4.根據權利要求1所述的一種乳酸鏈球菌素的生產方法，其特征在于：所述發酵的具體操作為：將高產菌株繼續發酵，直至進入對數生長期后向體系中加入2-2.2wt%的離子交換樹脂，再發酵23-24h后采用解析液對離子交換樹脂動態解吸，收集解吸液并加入氯化鈉至解析液飽和進行鹽析，隨后壓濾，洗脫，干燥，得到乳酸鏈球菌素。
5.一種權利要求1-4
6.一種食品保鮮劑，其特征在于：包括重量比為（0.5-0.6）:6的乳酸鏈球菌素微膠囊和精油膠囊，所述乳酸鏈球菌素微膠囊所用原料包括權利要求5所述的乳酸鏈球菌素、膠凝劑和氯化鈣溶液，所述精油膠囊包括殼聚糖、乳清蛋白粉、乳化劑和精油。
7.根據權利要求6所述的一種食品保鮮劑，其特征在于：所述膠凝劑為柚子皮果膠。
8.根據權利要求6所述的一種食品保鮮劑，其特征在于：所述氯化鈣水溶液中的氯化鈣濃度為4.5-6wt%。
9.根據權利要求6所述的一種食品保鮮劑，其特征在于：所述乳化劑為聚山梨酯-80。
10.根據權利要求6所述的一種食品保鮮劑，其特征在于：所述殼聚糖、乳清蛋白粉、乳化劑和精油的重量比為1:1:1.5:1.11。
...【技術特征摘要】
1.一種乳酸鏈球菌素的生產方法，包括以下步驟：誘變，篩選以及發酵，其特征在于：所述篩選的具體操作為：將誘變后得到的誘變菌懸液經過初篩，復篩后得到大抑菌圈的單菌落，將其置于ph=5.5-6.5的環境下發酵，發酵開始16-18h后檢測效價，篩出高產菌株，其中，檢測效價所用方法為電導率法或分光光度法。
2.根據權利要求1所述的一種乳酸鏈球菌素的生產方法，其特征在于：所述電導率法中的乳酸鏈球菌素標準品溶液中的乳酸鏈球菌素效價設置范圍為10-20?iu/ml。
3.根據權利要求1所述的一種乳酸鏈球菌素的生產方法，其特征在于：所述分光光度法中的乳酸鏈球菌素標準品溶液中的乳酸鏈球菌素效價設置范圍為5-20?iu/ml。
4.根據權利要求1所述的一種乳酸鏈球菌素的生產方法，其特征在于：所述發酵的具體操作為：將高產菌株繼續發酵，直至進入對數生長期后向體系中加入2-2.2wt%的離子交換樹脂，再發酵23-24h后采用解析液對離子交換...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李綺雯，劉曉君，容艷筠，邵錫賢，杜敬河，張天，李棟，甘海輝，
申請(專利權)人：廣東科隆生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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