【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及微生物，特別涉及一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、α-吡喃酮(α-pyrone)，又稱為查爾酮(chalcone)，是由細(xì)菌、真菌及植物等產(chǎn)生的一類不飽和六元環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)化合物，這一家族的化合物結(jié)構(gòu)多樣，具有抑制孢子萌發(fā)、抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、抗凝血劑、hiv蛋白酶抑制劑等多種生物活性，具有巨大的應(yīng)用潛力。germicidin?a～d是由鏈霉菌產(chǎn)生的四種最典型α-吡喃酮類化合物。
2、鏈霉菌是一類高g+c含量的革蘭氏陽性菌，是抗生素的主要來源。自然界分離的野生型鏈霉菌存在抗生素產(chǎn)量低、化合物結(jié)構(gòu)多樣性不夠、活性不高以及代謝產(chǎn)物基因簇沉默等問題，難以滿足人類對抗生素的需求，因此，需要通過遺傳操作手段(主要為接合轉(zhuǎn)移)對鏈霉菌進(jìn)行遺傳改造。
3、接合轉(zhuǎn)移是質(zhì)粒dna或者其他整合性元件(integrative?and?conjugativeelement,ice)通過直接接觸由供體菌向受體菌水平轉(zhuǎn)移的過程。不同細(xì)菌之間的接合轉(zhuǎn)移有不同方式，但幾乎所有革蘭氏陽性菌和陰性菌均是通過ⅳ型分泌系統(tǒng)形成接合孔介導(dǎo)質(zhì)粒dna從供體菌向受體菌轉(zhuǎn)移。然而以鏈霉菌為代表的放線菌不依賴ⅳ型分泌系統(tǒng)，它主要是通過一個質(zhì)粒編碼的蛋白trab形成接合孔介導(dǎo)質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)移。
4、然而，由于鏈霉菌廣泛存在的限制修飾系統(tǒng)，很多鏈霉菌都難以作為受體菌通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)行遺傳改造，極大地限制了鏈霉菌資源的開發(fā)與利用，導(dǎo)致新型抗生素的開發(fā)也受到極大的限制。
5、同時，現(xiàn)有促進(jìn)鏈霉
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一類能夠促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移的化合物germicidin?a～d，該類化合物大大提高了鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移率，可有效突破鏈霉菌難以通過接合轉(zhuǎn)移進(jìn)行遺傳改造的瓶頸，為通過遺傳改造鏈霉菌獲得活性更好、產(chǎn)量更高的菌株提供一種新的有效途徑。
2、本專利技術(shù)解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，所述α-吡喃酮類化合物可提高鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移效率，且α-吡喃酮類化合物具有如式i所示的結(jié)構(gòu)：
3、
4、式i中r1為ch3或h，r2為ch3或h，r3為ch3。
5、進(jìn)一步，所述α-吡喃酮類化合物為germicidin?a、germicidin?b、germicidin?c、germicidin?d，所述germicidin?a對應(yīng)式i中的r1和r2均為ch3，且c7為s構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)式如式ii所示；所述germicidin?b對應(yīng)式i中的r1為ch3、r2為h，其結(jié)構(gòu)式如式iii所示；所述germicidin?c對應(yīng)式i中的r1為h、r2為ch3，且c7為s構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)式如式iv所示；所述germicidin?d對應(yīng)式i中的r1和r2均為h，其結(jié)構(gòu)式如式v所示；
6、
7、
8、進(jìn)一步，在鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移步驟中，以鏈霉菌為受體菌，采用含α-吡喃酮類化合物的接合轉(zhuǎn)移平板進(jìn)行鏈霉菌與供體菌的接合轉(zhuǎn)移。
9、進(jìn)一步，所述接合轉(zhuǎn)移具體包括以下步驟：
10、1)受體菌的活化及孢子懸液的制備；
11、2)供體菌的活化及菌懸液的制備；
12、3)接合轉(zhuǎn)移平板的制備：向isp4培養(yǎng)基中加入mgcl2和α-吡喃酮類化合物，使mg2+和α-吡喃酮類化合物的終濃度分別為30mm和2～10nm，混勻后倒平板；；
13、4)接合轉(zhuǎn)移：先將受體菌的孢子懸液和供體菌的菌懸液混合均勻，得到混合菌懸液；然后將混合菌懸液涂布于接合轉(zhuǎn)移平板上，吹干后于培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)；再將培養(yǎng)好的平板取出，用apr抗生素和tmp抗生素進(jìn)行均勻覆蓋，吹干后于培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。
14、優(yōu)選地，所述α-吡喃酮類化合物的終濃度為2～5nm。
15、最優(yōu)選地，所述α-吡喃酮類化合物的終濃度為2nm。
16、進(jìn)一步，所述步驟4)中受體菌的孢子懸液與供體菌的菌懸液的體積比為100:1；所述混合菌懸液涂布于接合轉(zhuǎn)移平板時，其與接合轉(zhuǎn)移平板內(nèi)培養(yǎng)基的體積比為1:40，且涂布并吹干后進(jìn)行倒置培養(yǎng)的溫度為28℃，時間為16-20h。
17、進(jìn)一步，所述步驟4)中apr抗生素和tmp抗生素的終濃度分別為50μg/ml和100μg/ml，且apr抗生素和tmp抗生素進(jìn)行均勻覆蓋并吹干后進(jìn)行倒置培養(yǎng)的溫度為28℃，培養(yǎng)時間為3-5天。
18、進(jìn)一步，所述α-吡喃酮類化合物是從天藍(lán)色鏈霉菌a3(2)的發(fā)酵培養(yǎng)物中分離制備得到的。
19、進(jìn)一步，所述從天藍(lán)色鏈霉菌a3(2)的發(fā)酵培養(yǎng)物中分離制備α-吡喃酮類化合物的方法包括以下步驟：
20、a)制備種子液；
21、b)發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵培養(yǎng)物；
22、c)制備粗提物：將發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵液和菌絲體分離開，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取蒸餾濃縮后得到浸膏a，菌絲體用丙酮浸提，并經(jīng)超聲處理，收集浸提液經(jīng)蒸餾濃縮后得到浸膏b，將浸膏a與b合并為浸膏c，得到粗提物；
23、d)分離：浸膏c用甲醇溶解后，經(jīng)硅膠柱層析，以體積比從80:1～0：100的二氯甲烷-甲醇作為流動相梯度洗脫，收集二氯甲烷/甲醇體積比為50:1梯度洗脫下來的含有化合物germicidin?a-d的餾分fr.2；再將餾分fr.2經(jīng)硅膠柱層析，用二氯甲烷/乙酸乙酯作為洗脫劑，從體積比80:1～0：100進(jìn)行梯度洗脫，收集二氯甲烷/乙酸乙酯體積比為60:1梯度洗脫下來的含有化合物germicidin?a-d的餾分fr.2-2和fr.2-3；餾分fr.2-2和fr.2-3再經(jīng)半制備型hplc制備分離，離心濃縮儀冷凍抽干，得到化合物germicidin?a、b、c和d。
24、進(jìn)一步，所述步驟d)中hplc的條件為：色譜柱本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述α-吡喃酮類化合物可提高鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移效率，且α-吡喃酮類化合物具有如式I所示的結(jié)構(gòu)：
2.如權(quán)利要求1所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述α-吡喃酮類化合物為germicidin?A、germicidin?B、germicidin?C、germicidinD，所述germicidin?A對應(yīng)式I中的R1和R2均為CH3，且C7為S構(gòu)型；所述germicidin?B對應(yīng)式I中的R1為CH3、R2為H；所述germicidin?C對應(yīng)式I中的R1為H、R2為CH3，且C7為S構(gòu)型；所述germicidin?D對應(yīng)式I中的R1和R2均為H。
3.如權(quán)利要求1所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，在鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移步驟中，以鏈霉菌為受體菌，采用含α-吡喃酮類化合物的接合轉(zhuǎn)移平板進(jìn)行鏈霉菌與供體菌的接合轉(zhuǎn)移。
4.如權(quán)利要求3所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述接合轉(zhuǎn)移具體包括以下
5.如權(quán)利要求4所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟4)中受體菌的孢子懸液與供體菌的菌懸液的體積比為100:1；所述混合菌懸液涂布于接合轉(zhuǎn)移平板時，其與接合轉(zhuǎn)移平板內(nèi)培養(yǎng)基的體積比為1:40，且涂布并吹干后進(jìn)行倒置培養(yǎng)的溫度為28℃，時間為16-20h。
6.如權(quán)利要求4所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟4)中Apr抗生素和TMP抗生素的終濃度分別為50μg/mL和100μg/mL，且Apr抗生素和TMP抗生素進(jìn)行均勻覆蓋并吹干后進(jìn)行倒置培養(yǎng)的溫度為28℃，培養(yǎng)時間為3-5天。
7.如權(quán)利要求2所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述α-吡喃酮類化合物是從天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)的發(fā)酵培養(yǎng)物中分離制備得到的。
8.如權(quán)利要求7所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述從天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)的發(fā)酵培養(yǎng)物中分離制備α-吡喃酮類化合物的方法包括以下步驟：
9.如權(quán)利要求8所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟d)中HPLC的條件為：色譜柱為Agilent?Ultimate?XB-C18柱；流動相包括A相和B相，流動相A相：10％(v/v)的乙腈+0.08％(v/v)的甲酸，溶劑為水；流動B相：90％(v/v)的乙腈，溶劑為水；梯度洗脫程序如下：
10.如權(quán)利要求2所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述germicidin?A、germicidin?B、germicidin?C、germicidin?D中的任意一種作為促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移的活性成分用于制備促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移的試劑。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述α-吡喃酮類化合物可提高鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移效率，且α-吡喃酮類化合物具有如式i所示的結(jié)構(gòu)：
2.如權(quán)利要求1所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述α-吡喃酮類化合物為germicidin?a、germicidin?b、germicidin?c、germicidind，所述germicidin?a對應(yīng)式i中的r1和r2均為ch3，且c7為s構(gòu)型；所述germicidin?b對應(yīng)式i中的r1為ch3、r2為h；所述germicidin?c對應(yīng)式i中的r1為h、r2為ch3，且c7為s構(gòu)型；所述germicidin?d對應(yīng)式i中的r1和r2均為h。
3.如權(quán)利要求1所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，在鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移步驟中，以鏈霉菌為受體菌，采用含α-吡喃酮類化合物的接合轉(zhuǎn)移平板進(jìn)行鏈霉菌與供體菌的接合轉(zhuǎn)移。
4.如權(quán)利要求3所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述接合轉(zhuǎn)移具體包括以下步驟：
5.如權(quán)利要求4所述一種α-吡喃酮類化合物在促進(jìn)鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟4)中受體菌的孢子懸液與供體菌的菌懸液的體積比為100:1；所述混合菌懸液涂布于接合轉(zhuǎn)移平板時，其與接合轉(zhuǎn)移平板內(nèi)培養(yǎng)基的體積比為1:40，且涂布并吹干后進(jìn)行倒置培養(yǎng)的溫度為28℃，時間...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：余子全，丁軒，屈文華，田晨曦，李佩芝，
申請(專利權(quán))人：湖南師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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