【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及豌豆遺傳轉化體系建立領域，尤其涉及一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法。
技術介紹
1、豌豆(pisum?sativum?l.)是世界四大食用豆類作物之一，栽培歷史悠久。豌豆適應性強，耐寒耐貧瘠，且營養豐富，糧、菜、飼兼用。豌豆又因其固氮作用成為調整種植業結構的重要間、套作作物，可改良土壤狀況，提高土壤肥力，減少化肥污染，增加作物產量等。豌豆也是我國南方主要的冬季作物、北方主要的早春作物之一，在我國的可持續農業發展和我國人民的膳食結構中產生著重要的影響。盡管豌豆的種植面積很大，但總產量仍然很低。一些生物和非生物脅迫嚴重影響著豌豆的產量；豌豆育種中存在高產、抗病和優質品種缺乏的問題，尤其是北方缺乏抗凍豌豆品種。此外，豌豆自花授粉，遺傳基礎狹窄，傳統的常規育種又存在效率低、育種周期長、可利用的抗性資源少且經常伴隨農藝性狀較差的問題，重要農藝性狀基因的功能驗證與快速轉育也面臨著巨大的挑戰。因此，利用基因工程技術進行種質改良不失為一條有效途徑，同時也為近年來發掘與克隆的重要基因功能解析奠定堅實的基礎。
2、然而豆科植物特別是豌豆的轉基因一直是世界范圍內的研究難題，早在20世紀70年代，malmberg等就開始了豌豆組織培養的研究。先后有通過原生質體和一系列外植體進行豌豆不定芽再生和體細胞胚胎發生的報道。但豆科植物再生較為困難，豌豆再生的研究由于依賴于基因型、再生頻率低、可重復性差等原因進展緩慢。國內外眾多學者進行豌豆組織培養研究多通過體細胞胚胎發生和器官發生兩個途徑進行，雖然在豌豆組織培養的關鍵影響因素如基因型、外植
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術提供了一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法。
2、為解決上述技術問題，本專利技術采取了如下技術方案：
3、一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，包括以下步驟：
4、步驟1、植物表達載體轉化農桿菌感受態細胞
5、步驟1.1、取eha105農桿菌感受態待其部分融化，處于冰水混合狀態時插入冰浴中；
6、步驟1.2、加crispr/cas9基因編輯載體質粒dna，混勻，依次于冰上靜置、液氮、水浴、冰浴；
7、步驟1.3、加入無抗生素的lb液體培養基，震蕩培養；
8、步驟1.4、離心收菌，留取上清，吹打重懸菌塊涂布于含卡那霉素和利福平抗性的lb平板上，倒置放培養箱暗培養；
9、步驟2、農桿菌菌液制備與保存
10、步驟2.1、挑取農桿菌單菌落，劃線到含卡那霉素和利福平抗性的lb平板上，倒置放于培養箱暗培養；
11、步驟2.2、用接種環蘸取農桿菌菌落到含卡那霉素和利福平抗性的lb液體培養基中，震蕩培養；
12、步驟2.3、吸取菌液到離心管中，并加入甘油，混勻，放在液氮中，將凍存好的農桿菌菌液放在冰箱備用；
13、步驟3、豌豆無菌苗的制備
14、步驟3.1、對豌豆進行密閉消毒；
15、步驟3.2、將豌豆種子接種至萌發培養基培養；
16、步驟4、外植體的侵染與共培養
17、步驟4.1、進行兩次農桿菌菌液活化；
18、步驟4.2、將萌發好的無菌苗取出，子葉對半切開，留下胚軸；
19、步驟4.3、取活化好的農桿菌菌液，測量其在600nm波長下的吸光值，將剩下的農桿菌菌液離心、收集菌體，倒掉上層清液，用侵染液體培養基將菌體重懸，并激活菌體；將外植體放到重懸活化好的菌液中，先靜置再不斷晃動，倒掉菌液，將外植體放在墊有無菌濾紙的培養皿上，吸去并吹干多余的菌液，然后接種在共培養培養基上培養；
20、步驟5、恢復培養
21、用洗液清洗外植體，將外植體放在墊有無菌濾紙的培養皿上，吸去并吹干多余的液體，然后接種在恢復培養培養基上培養；
22、步驟6、芽誘導培養
23、將外植體接種到芽誘導培養基上進行芽誘導和篩選培養，一輪篩選結束，將子葉節取出切除長勢明顯的胚芽，移入新鮮的芽誘導培養基作為二輪篩選培養；
24、步驟7、芽伸長培養
25、挑選萌發出叢生芽的子葉節，并將子葉切除，下胚軸切出新的傷口，接入芽伸長培養基中培養；
26、步驟8、生根培養
27、待叢生芽長至2-3厘米左右，將芽體切下移至生根培養基中進行生根培養。
28、優選的，所述步驟3中，豌豆消毒的方法為：挑選飽滿干凈、生長狀態好的豌豆種子平鋪在無菌培養皿中，將放置豌豆的培養皿放在密封狀態良好的干燥器中，將200ml次氯酸鈉溶液放在500ml的小燒杯中，并將小燒杯放在干燥器內，移液槍取10ml濃鹽酸加入放有次氯酸鈉溶液的燒杯中，并迅速蓋好干燥器的蓋子，密閉消毒8-10h以上。
29、優選的，所述步驟3中，萌發培養基配方為：
30、
31、培養條件為：16h光照/8h黑暗，光照強度3000lux，培養溫度25℃。
32、優選的，所述步驟4中，進行兩次農桿菌菌液活化的方法為：侵染前三天將凍存的農桿菌菌液劃線到含卡那霉素和利福平抗性的lb平板上，倒置放于28℃培養箱暗培養2-3天，進行第一次菌體活化。侵染前一天晚上用接種環將活化的菌體蘸取到含卡那霉素和利福平抗性的lb液體培養基中，200rpm，28℃震蕩培養過夜，進行二次活化。
33、優選的，所述步驟4中，侵染液體培養基配方為：
34、
35、
36、優選的，所述步驟4中，培養基配方為：
37、
38、培養條件為：黑暗，培養溫度28℃。
39、優選的，所述步驟5中，恢復培養基配方為：
40、
41、
42、培養條件為：16h光照/8h黑暗，光照強度3000lux，培養溫度28℃。
43、優選的，所述步驟6中，芽誘導培養基配方為：
44、
45、培養條件為：16h光照/8h黑暗，光照強度3000lux，培養溫度28℃。
46、優選的，所述步驟7中，芽伸長培養基配方為：
47、
48、培養條件為：16h光照/8h黑暗，光照強度3000lux，培養溫度28℃。
49、優選的，所述步驟8中，生根培養基配方為：
50、
51、
52、培養條件為：本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟3中，豌豆消毒的方法為：挑選飽滿干凈、生長狀態好的豌豆種子平鋪在無菌培養皿中，將放置豌豆的培養皿放在密封狀態良好的干燥器中，將200mL次氯酸鈉溶液放在500mL的小燒杯中，并將小燒杯放在干燥器內，移液槍取10mL濃鹽酸加入放有次氯酸鈉溶液的燒杯中，并迅速蓋好干燥器的蓋子，密閉消毒8-10h以上。
3.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟3中，萌發培養基配方為：
4.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟4中，進行兩次農桿菌菌液活化的方法為：侵染前三天將凍存的農桿菌菌液劃線到含卡那霉素和利福平抗性的LB平板上，倒置放于28℃培養箱暗培養2-3天，進行第一次菌體活化。侵染前一天晚上用接種環將活化的菌體蘸取到含卡那霉素和利福平抗性的LB液體培養基中，200rpm，28℃震蕩培養過夜，進行二次活化。
5.根據權利要求1所述的一種豌豆
6.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟4中，培養基配方為：
7.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟5中，恢復培養基配方為：
8.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟6中，芽誘導培養基配方為：
9.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟7中，芽伸長培養基配方為：
10.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟8中，生根培養基配方為：
...【技術特征摘要】
1.一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟3中，豌豆消毒的方法為：挑選飽滿干凈、生長狀態好的豌豆種子平鋪在無菌培養皿中，將放置豌豆的培養皿放在密封狀態良好的干燥器中，將200ml次氯酸鈉溶液放在500ml的小燒杯中，并將小燒杯放在干燥器內，移液槍取10ml濃鹽酸加入放有次氯酸鈉溶液的燒杯中，并迅速蓋好干燥器的蓋子，密閉消毒8-10h以上。
3.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟3中，萌發培養基配方為：
4.根據權利要求1所述的一種豌豆遺傳轉化體系建立的方法，其特征在于，所述步驟4中，進行兩次農桿菌菌液活化的方法為：侵染前三天將凍存的農桿菌菌液劃線到含卡那霉素和利福平抗性的lb平板上，倒置放于28℃培養箱暗培養2-3天，進行第一次菌體活化。侵...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李冠，李娜娜，賈凱華，李如志，
申請(專利權)人：山東省農業科學院，
類型：發明
國別省市：
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