【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物檢測，具體涉及一種用于區分滑液囊支原體ms-h疫苗株與野毒株的snp位點、試劑盒及應用。
技術介紹
1、雞滑液囊支原體(mycoplasma?synoviae，ms)感染家禽后可引起滑液囊炎、氣囊炎，導致蛋雞產蛋量及其品質下降，種蛋孵化率降低，雛雞淘汰率增高，影響肉雞生長發育等。ms長期存在于雞群中，?；旌细腥酒渌≡缧鲁且卟《尽⒋竽c桿菌等，給家禽養殖業造成巨大經濟損失。因此，ms的防控凈化一直是困擾養禽業的難題，也是現代集約化養禽業的研究重點。
2、目前用于預防ms感染的活疫苗主要為澳大利亞的減毒活疫苗毒株ms-h。活疫苗的應用一方面可通過在上呼吸道的定植對野毒株感染產生競爭排斥作用，另一方面也能產生有效的粘膜免疫應答。該疫苗的應用可以顯著減輕臨床癥狀，但不可完全避免野毒株的感染。此外，由于ms能夠發生水平傳播和垂直傳播，對血清學監測結果造成干擾，使免疫雞群與野毒感染雞群難以區分。因此，為了監測雞群的感染情況，并實現ms控制和根除計劃，急需建立一種更準確的檢測方法對感染動物和接種動物進行區分(differentiationofinfected?from?vaccinated?animals,diva)。
3、ms的鑒別診斷方法包括血清學方法和分子生物學檢測。血清學診斷存在非特異性反應和交叉反應，易出現假陽性結果。分子生物學技術是目前使用較為廣泛的檢測方法，可快速檢測樣品中的ms，大大推進檢測效率。但是，常規pcr方法特異性低，復雜樣品中的某些成分對pcr擴增存在抑制作用，容易產生
4、近年來，基于snp的qpcr檢測方法被廣泛應用。r.dijkman等(dijkman?r,feberweea,landman?w?j?m.development,validation?and?wild-type?evaluation?ofaquantitative?real-time?pcr?able?to?differentiate?between?wild-type?mycoplasmasynoviae?and?the?ms-h-live?vaccine?strain[j].avian?pathology,2017,46(4):403-415.)和劉瑞東等(liu?r,lin?q,cai?q,et?al.a?novel?high?sensitive,specificityduplex?enzyme-activated?differentiating?probes?pcr?method?for?the?snpdetection?and?differentiation?ofms-h?vaccine?strains?from?wild-typemycoplasma?synoviae?strains[j].poult?sci,2024,103(8):103874.)都建立了基于obg基因中的snp突變位點對ms疫苗株和野毒株進行鑒別的qpcr方法。但是，研究發現，部分ms-h再分離株的obg、oppf基因型可恢復為野毒株，故基于該位點建立的檢測方法結果存在誤差(klose?sm,olaogun?om,disint?j?f,et?al.genomic?diversity?of?a?globally?used,live?attenuated?mycoplasma?vaccine[j].microbiology?spectrum,2022,10(6):e0284522.)。因此，篩選穩定的可區分ms疫苗株ms-h與野毒株的snp位點，并基于新位點建立一種高效、準確的檢測方法，對支原體感染雞群的凈化意義重大。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種用于區分滑液囊支原體ms-h疫苗株與野毒株的snp位點、試劑盒及應用，為鑒別ms-h株與野毒株的檢測方法的建立提供了可靠的鑒定靶點，極大的提高了臨床檢測的準確性和可信度，彌補了現有檢測方法的不足。
2、本專利技術的目的是通過如下技術方案實現的：
3、本專利技術提供了一種用于區分滑液囊支原體ms-h疫苗株與野毒株的snp位點，所述snp位點包括21個，具體如下表所示：
4、
5、
6、本專利技術還提供了一種可用于區分滑液囊支原體ms-h疫苗株與野毒株的特異性引物和探針組合，所述特異性引物和探針組合基于基因編號為msh_02655的ktrb位點進行設計，所述特異性引物包括序列分別如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的特異性引物ms-ktrb-f和ms-ktrb-r，所述探針組合包括序列分別如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的疫苗株ms-h特異性探針ms-ktrb-vp和ms野毒株特異性探針ms-ktrb-wp。
7、進一步的，所述疫苗株ms-h特異性探針ms-ktrb-vp的5’端標記有fam報告基團，3’端標記有mgb淬滅基團，所述ms野毒株特異性探針ms-ktrb-wp的5’端標記有cy5報告基團，3’端標記有mgb淬滅基團。
8、本專利技術還提供了一種利用所述的引物組合物制備得到的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括所述的特異性引物和探針組合。
9、進一步的，所述試劑盒還包括2種陽性標準品、2×aceq?universal?u+probemaster?mix?v2和無菌超純水。
10、進一步的，所述2種陽性標準品分別為含有關鍵性ktrb822突變位點在內的疫苗株ms-h和野毒株ms?wvu1853的ktrb基因片段的質粒。
11、本專利技術還提供了一種用于區分滑液囊支原體疫苗株ms-h與野毒株的方法，所述方法包括利用所述的試劑盒對待測樣品進行檢測的步驟。
12、進一步的，具體包括以下步驟：
13、(1)提取待檢樣本的基因組dna；
14、(2)將陽性標準品質粒從107拷貝/μl到100拷貝/μl梯度稀釋作為模板，以所述的特異性引物和探針組合進行熒光定量pcr擴增，用于建立標準曲線；
15、(3)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以所述的特異性引物和探針組合進行熒光定量pcr擴增。
16、(4)觀察步驟(3)中熒光定量pcr擴增是否有特征性s曲線，當檢測到cy5信號且呈現特征性s曲線判定為ms野毒株，當檢測到fam信號且呈現特征性s曲線判定為ms-h疫苗株，在曲線正常的基礎上，根據步驟(2)中所建立的標準曲線對待檢樣本中的菌株dna含量進行定量。
17、進一步的，所述熒光定量pcr擴增的反應體系為20μl，含有2×aceq?universal?u+probe?master?mix?v210μl，10μm?m本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于區分滑液囊支原體MS-H疫苗株與野毒株的SNP位點，其特征在于，所述SNP位點包括21個，具體如下表所示：
2.一種可用于區分滑液囊支原體MS-H疫苗株與野毒株的特異性引物和探針組合，其特征在于，所述特異性引物和探針組合基于權利要求1中基因編號為MSH_02655的ktrB位點進行設計，所述特異性引物包括序列分別如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的特異性引物MS-ktrB-F和MS-ktrB-R，所述探針組合包括序列分別如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示的疫苗株MS-H特異性探針MS-ktrB-VP和MS野毒株特異性探針MS-ktrB-WP。
3.如權利要求2所述的特異性引物和探針組合，其特征在于，所述疫苗株MS-H特異性探針MS-ktrB-VP的5’端標記有FAM報告基團，3’端標記有MGB淬滅基團，所述MS野毒株特異性探針MS-ktrB-WP的5’端標記有CY5報告基團，3’端標記有MGB淬滅基團。
4.一種利用權利要求2-3任一項所述的引物組合物制備得到的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括2種陽性標準品、2×AceQ?Universal?U+Probe?Master?Mix?V2和無菌超純水。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述2種陽性標準品分別為含有關鍵性ktrB822突變位點在內的疫苗株MS-H和野毒株MS?WVU1853的ktrB基因片段的質粒。
7.一種用于區分滑液囊支原體疫苗株MS-H與野毒株的方法，其特征在于，所述方法包括利用權利要求4-6任一項所述的試劑盒對待測樣品進行檢測的步驟。
8.如權利要求7所述的用于區分滑液囊支原體疫苗株MS-H與野毒株的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：
9.如權利要求8所述的用于區分滑液囊支原體疫苗株MS-H與野毒株的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR擴增的反應體系為20μL，含有2×AceQ?Universal?U+Probe?MasterMix?V210μL，10μM?MS-ktrB-F?0.8μL,10μM?MS-ktrB-R?0.8μL,10μM?MS-ktrB-VP?0.4μL,10μM?MS-ktrB-WP?0.4μL,模板2μL，無菌超純水5.6μL；所述熒光定量PCR擴增的反應程序為：37℃污染消化2min；95℃預變性5min；95℃變性10s，60℃退火35s，45個循環。
10.如權利要求1所述的SNP位點或權利要求2-3任一項所述特異性引物和探針組合或權利要求4-6任一項所述的試劑盒在區分滑液囊支原體MS-H疫苗株與野毒株中的應用，其特征在于，所述區分滑液囊支原體MS-H疫苗株與野毒株的主要依據在于MS-H及其親本株中具有穩定的SNP突變，在所有野毒株中的SNP位點均與親本株的突變一致，在MS-H及其所有重分離株中的SNP位點均具有區別于野毒株的一致性突變。
...【技術特征摘要】
1.一種用于區分滑液囊支原體ms-h疫苗株與野毒株的snp位點，其特征在于，所述snp位點包括21個，具體如下表所示：
2.一種可用于區分滑液囊支原體ms-h疫苗株與野毒株的特異性引物和探針組合，其特征在于，所述特異性引物和探針組合基于權利要求1中基因編號為msh_02655的ktrb位點進行設計，所述特異性引物包括序列分別如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的特異性引物ms-ktrb-f和ms-ktrb-r，所述探針組合包括序列分別如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的疫苗株ms-h特異性探針ms-ktrb-vp和ms野毒株特異性探針ms-ktrb-wp。
3.如權利要求2所述的特異性引物和探針組合，其特征在于，所述疫苗株ms-h特異性探針ms-ktrb-vp的5’端標記有fam報告基團，3’端標記有mgb淬滅基團，所述ms野毒株特異性探針ms-ktrb-wp的5’端標記有cy5報告基團，3’端標記有mgb淬滅基團。
4.一種利用權利要求2-3任一項所述的引物組合物制備得到的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求2所述的特異性引物和探針組合。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括2種陽性標準品、2×aceq?universal?u+probe?master?mix?v2和無菌超純水。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述2種陽性標準品分別為含有關鍵性ktrb822突變位點在...
【專利技術屬性】
技術研發人員：祁晶晶，王少輝，趙鹿如，田明星，鮑衍清，胡劍剛，
申請(專利權)人：中國農業科學院上海獸醫研究所中國動物衛生與流行病學中心上海分中心，
類型：發明
國別省市：
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