【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因編輯領域，具體而言，涉及一種cas蛋白、其基因編輯系統及應用。
技術介紹
1、clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(crispr)系統,是細菌和古細菌為了防御入侵噬菌體的dna而形成的。crispr系統的免疫干擾過程主要包括3個階段：適應、表達和干擾。適應階段，crispr系統會將來自噬菌體或質粒的dna短片段整合到前導序列和第一段重復序列之間，每一次整合都伴隨著重復序列的復制，進而形成一個新的重復-間隔序列單元。表達階段，crispr基因座會被轉錄成一段crispr?rna(crrna)前體(pre-crrna)，該前體在cas蛋白和tracrrna的存在下會在重復序列處被進一步加工成小的crrna。成熟的crrna與cas蛋白形成cas/crrna復合體。干擾階段，crrna通過其與靶序列互補的區域引導cas/crrna復合體尋找靶點，并在靶點位置通過cas蛋白的核酸酶活性造成靶點位置的雙鏈dna斷裂，從而使靶標dna失去原有功能。crispr系統分為i，ii，ii?i型三個家族，其中ii型系統最常見的為crispr/cas9系統，cas9蛋白可在反式編碼小rna(trans-encodedsmal?lrna，tracrrna)的協助下將pre-crrna加工成與tracrrna結合的成熟crrna。之后，人們發現通過人工構建模擬crrna：tracrrna復合體的單鏈嵌合體引導rna(guiderna)，即可有效的介導cas9蛋白對靶點的
技術實現思路
1、本專利技術的主要目的在于提供一種新的cas蛋白、其組合物及應用，以滿足上述應用需求。基于此，本專利技術還提供了新的crispr-cas組合物以及基于該系統的基因編輯方法和核酸檢測方法。
2、在一個方面，本專利技術提供了一種cas蛋白，其包含與seq?id?nos.1-4中任一條氨基酸序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列，并且基本保留了其源自的序列的生物學功能；
3、在一個實施方案中，所述cas蛋白的氨基酸序列與seq?id?nos.1-4任意一條氨基酸序列相比，具有一個或多個氨基酸的置換、缺失或添加的序列，并且基本保留了其源自的序列的生物學功能；
4、在一個實施方案中，所述的cas蛋白，其包含seq?id?nos.1-4任一項所示的氨基酸序列；
5、或與seq?id?nos.1-4任一項所示的序列相比，具有一個或多個氨基酸的置換、缺失或添加(例如1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個氨基酸的置換、缺失或添加)的序列；或與seq?id?nos.1-4任一項所示的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列同一性的序列；
6、在一個實施方案中，所述蛋白具有seq?id?nos.1-4任一項所示的氨基酸序列。
7、本領域技術人員清楚，可以改變蛋白質的結構而不對其活性和功能性產生不利影響，例如在蛋白質氨基酸序列中引入一個或多個保守性氨基酸取代，而不會對蛋白質分子的活性和/或三維結構產生不利影響。
8、本領域技術人員清楚保守性氨基酸取代的實例以及實施方案。具體的說，可以用與待取代位點屬于相同組的另一氨基酸殘基取代該氨基酸殘基，即用非極性氨基酸殘基取代另一非極性氨基酸殘基，用極性不帶電荷的氨基酸殘基取代另一極性不帶電荷的氨基酸殘基，用堿性氨基酸殘基取代另一堿性氨基酸殘基，和用酸性氨基酸殘基取代另一酸性氨基酸殘基。這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的。只要取代不導致蛋白質生物活性的失活，則一種氨基酸被屬于同組的其他氨基酸替換的保守取代落在本專利技術的范圍內。因此，本專利技術的蛋白可以在氨基酸序列中包含一個或多個保守性取代,這些保守性取代最好根據表1進行替換而產生。另外，本專利技術也涵蓋還包含一個或多個其他非保守取代的蛋白，只要該非保守取代不顯著影響本專利技術的蛋白質的所需功能和生物活性即可。
9、保守氨基酸置換可以在一個或多個預測的非必需氨基酸殘基處進行。“非必需”氨基酸殘基是可以發生改變(缺失、取代或置換)而不改變生物活性的氨基酸殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性所需的。“保守氨基酸置換”是其中氨基酸殘基被具有類似側鏈的氨基酸殘基替代的置換。氨基酸置換可以在cas酶的非保守區域中進行。一般而言，此類置換不對保守的氨基酸殘基，或者不對位于保守基序內的氨基酸殘基進行，其中此類殘基是蛋白質活性所需的。然而，本領域技術人員應當理解，功能變體可以具有較少的在保守區域中的保守或非保守改變。
10、在某些實施方案中，被認為是相互保守性置換的氨基酸的所選組：
11、
12、本領域技術人員已經知曉，從蛋白質的n和/或c末端改變(置換、刪除、截短或插入)一或多個氨基酸殘基而仍可以保留其功能活性。因此，從本專利技術的cas蛋白的n和/或c末端改變了一或多個氨基酸殘基、同時保留了其所需功能活性的蛋白，也在本專利技術的范圍內。這些改變可以包括通過現代分子方法例如pcr而引入的改變，所述方法包括借助于在pcr擴增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸編碼序列而改變或延長蛋白質編碼序列的pcr擴增。
13、應認識到，蛋白質可以以各種方式進行改變，包括氨基酸置換、刪除、截短和插入，用于此類操作的方法是本領域技術人員通常已知曉的。
14、例如，可以通過對dna的突變來制備cas蛋白的氨基酸序列變體。還可以通過其他誘變形式和/或通過定向進化來完成，例如，使用已知的誘變、重組和/或改組方法，結合相關的篩選方法，來進行一或多個氨基酸取代；或一至多個氨基酸的缺失和/一至多個氨基酸插入。
15、本領域技術人員能夠理解，本專利技術cas蛋白中的這些微小氨基酸變化可以出現(例如，天然存在的突變)或者產生(例如，可使用r-dna技術)而不損失蛋白質功能或活性。如果這些突變出現在蛋白的催化結構域、活性位點或其它功能結構域中，則多肽的性質可改變，但多肽可保持其活性。如果存在的突變不接近催化結構域、活性位點或其它功能結本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種Cas蛋白，其特征在于，所述蛋白選自下組：
2.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括權利要求1所述的Cas蛋白和一個或多個功能結構域。
3.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸為編碼權利要求1所述的Cas蛋白或權利要求2中所述融合蛋白的核苷酸序列，或編碼權利要求3中所述融合蛋白的核苷酸序列。
4.一種CRISPR-Cas組合物，所述組合物包含：
5.根據權利要求4所述的CRISPR-Cas組合物，其包括一個或多個載體，所述一個或多個載體包含：
6.一種遞送系統，其特征在于，所述遞送系統包括權利要求1所述的Cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4-5任一項所述的CRISPR-Cas組合物。
7.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求1所述的Cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4-5中任一項所述的CRISPR-Cas組合物，或權利要求6所述的遞送系統。
8.一種靶向和編輯靶核酸或切割靶核酸的方法，其特征在
9.一種在識別靶核酸后非特異性降解或切割單鏈核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述靶核酸的靶序列與權利要求4-5任一項所述的CRISPR-Cas組合物接觸。
10.一種靶向和切割雙鏈靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述雙鏈靶核酸與權利要求4-5任一項CRISPR-Cas組合物接觸。
11.一種誘導細胞狀態改變的方法，其特征在于，所述方法包括使權利要求4-5中任一項所述的CRISPR-Cas組合物與細胞中的所述靶核酸接觸。
12.一種試劑盒，包括權利要求1所述的Cas蛋白、權利要求2所述的融合蛋白或權利要求3中的多核苷酸，或權利要求4-5任一項所述的CRISPR-Cas組合物，或權利要求6所述宿主細胞，所述試劑盒的組分在相同或不同的容器中。
13.根據權利要求12所述的試劑盒，所述試劑盒用于基因或基因組編輯、疾病治療、靶向靶基因、切割目的基因或非目的基因的一種或多種。
14.一種檢測樣品中靶核酸的方法，所述方法包括將樣品與權利要求4-5任一項所述的CRISPR-Cas組合物和非靶序列接觸；檢測非靶序列被切割產生的可檢測信號，從而檢測靶核酸；所述非靶序列不與所述向導RNA雜交。
15.權利要求1所述的Cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4-5任一項所述的CRISPR-Cas組合物，或權利要求6所述的遞送系統，或權利要求7所述的宿主細胞，或所述權利要求8-10在核酸檢測中的應用。
16.權利要求1所述的Cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4-5任一項所述的CRISPR-Cas組合物，或權利要求6所述的遞送系統，或權利要求7所述的宿主細胞在制備用于治療有需要的受試者的病癥或疾病的藥物中的應用。
17.根據權利要求16所述的應用，所述病癥或疾病包括囊性纖維化、進行性假肥大性肌營養不良、貝克肌營養不良、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、龐貝病、強直性肌營養不良、亨廷頓病、脆性X綜合征、弗里德賴希共濟失調、肌萎縮側索硬化、額顳葉癡呆、遺傳性慢性腎臟病、高脂血癥、高膽固醇血癥、萊伯氏先天性黑蒙、鐮狀細胞病、高膽固醇血癥、轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變或β-地中海貧血中的一種或多種。
...【技術特征摘要】
1.一種cas蛋白，其特征在于，所述蛋白選自下組：
2.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括權利要求1所述的cas蛋白和一個或多個功能結構域。
3.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸為編碼權利要求1所述的cas蛋白或權利要求2中所述融合蛋白的核苷酸序列，或編碼權利要求3中所述融合蛋白的核苷酸序列。
4.一種crispr-cas組合物，所述組合物包含：
5.根據權利要求4所述的crispr-cas組合物，其包括一個或多個載體，所述一個或多個載體包含：
6.一種遞送系統，其特征在于，所述遞送系統包括權利要求1所述的cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4-5任一項所述的crispr-cas組合物。
7.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求1所述的cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4-5中任一項所述的crispr-cas組合物，或權利要求6所述的遞送系統。
8.一種靶向和編輯靶核酸或切割靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述靶核酸與權利要求1所述的cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3中的多核苷酸，或權利要求4-5任一項所述的crispr-cas組合物，或權利要求6所述宿主細胞接觸。
9.一種在識別靶核酸后非特異性降解或切割單鏈核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述靶核酸的靶序列與權利要求4-5任一項所述的crispr-cas組合物接觸。
10.一種靶向和切割雙鏈靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述雙鏈靶核酸與權利要求4-5任一項crispr-cas組合物接觸。
11.一種誘導細胞狀態改變的方法，其特征在于，所述方法包括使權...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張紅玲，蔡文慧，
申請(專利權)人：堯唐南京生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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