【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及使用堿基編輯器用于高效地基因工程化細胞的方法，尤其是原代造血干細胞(hsc)和原代免疫細胞。具體而言，本專利技術涉及用于設計高活性和特異性的tale-堿基編輯器的規則，該編輯器展現出改進的靶向/脫靶活性比，可用于制造治療級別的復雜基因編輯細胞或進行體內基因治療。所得的tale-堿基編輯器可以在各種基因治療方法中單獨使用或者與稀有-切割核酸內切酶結合使用。
技術介紹
1、人工轉錄激活因子樣效應物(tale)形成一類特殊的蛋白，其可以結合最初源自植物病原菌屬黃單胞菌(xanthomonas)的dna[kay?s.et?al.(2007)a?bacterial?effectoracts?as?a?plant?transcription?factor?and?induces?a?cell?sizeregulator.science?318:648-651]。人工tale蛋白已成為多功能且序列特異性的基因工具，其在解析(elucidation，闡明)dna識別“密碼”后，將tale的氨基酸序列與其所結合的基因組dna序列連接，提供靈活的應用[moscou?j.m.et?al.(2009)a?simple?cipher?governsdna?recognition?by?tal?effectors.science.326:1501]。
2、tale結合是由一系列33至35個氨基酸長的重復段(repeat)驅動的，該重復段本質上在兩個位置是不同的，即所謂的重復可變二肽(rvd)。dna靶標中一條鏈的每個堿基都與單獨的
3、tale-堿基編輯器(be)最近更多作為tale與脫氨酶(以及有時與其他dna修復蛋白)的融合物出現。堿基編輯器催化結構域可以在分裂細胞和非分裂細胞兩者的dna(核dna或細胞器dna)或rna中的所需位點處引入單核苷酸變體。大體上，dna堿基編輯器可分為胞嘧啶堿基編輯器(cbe)、腺嘌呤堿基編輯器(abe)、c-到-g堿基編輯器(cgbe)、雙堿基編輯器和細胞器堿基編輯器。
4、mok等[a?bacterial?cytidine?deaminase?toxin?enables?crispr-freemitochondrial?base?editing(2020)nature.583:631-637]最近開發了堿基編輯方法，該方法通過將tale結合域與細菌胞苷脫氨酶毒素dddatox融合，以證明體外線粒體基因組上c-到-t堿基的有效轉化。在這種方法中，dddatox被拆分成無毒的兩半，分別與成對(左和右)的tale結合域的c-末端融合，以形成異二聚體tale堿基編輯器。
5、在這種情況下，當脫氨酶dddatox的兩半通過tale結合域識別基因組中預定的靶標dna序列足夠靠近時，通過形成將位于兩個結合位點之間的c堿基轉化為t的功能性異二聚體胞嘧啶脫氨酶，脫氨酶dddatox就會變得活躍。到目前為止，這種ddda-tale融合脫氨酶構建體已經在小鼠體內實現了線粒體dna編輯[lee,h.,et?al.(2021)mitochondrial?dnaediting?in?mice?with?ddda-tale?fusion?deaminases.nat?commun?12:1190]。
6、然而，線粒體基因組比人類細胞的核基因組要小得多。
7、在人類細胞中，尤其是免疫治療細胞中，使用這種堿基編輯器已被證明非常有挑戰性。特別是在人類基因治療中，確定在靶標位點誘導c-到-t堿基編輯的編輯窗口變得至關重要，以避免位于其他位置的任何c堿基不必要地替換到近端基因組區域。
8、根據基因組中待靶向的序列以及它們在人類群體中的內在變異性，tale-堿基編輯器需要進一步改進，以充分發揮其活性并減少潛在的脫靶替換風險。
9、如本文實驗部分所示，本專利技術人已進行了廣泛的研究以確定規則，該規則允許確定與高效tale堿基編輯器的設計相關的最佳靶標基因組序列。他們將篩選靶向各種內源性位點的數十種tale堿基編輯器與開發中/高通量基于細胞的分析相結合，該分析可以充分利用由于諸如表觀基因組因素或修飾的混雜效應造成的偏差。這種方法依賴于為堿基編輯器創建含有人工靶標的細胞池。這些細胞是通過將一組(30到191個成員)精心設計的be靶標序列插入到預先確定的基因組位點而生成的。然后，用各種tale堿基編輯器處理該細胞池，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.用于在雙鏈核酸序列中設計和生產TALE堿基編輯器異二聚體以將特定的C轉化為A和/或將C互補的G位置轉化為T的方法，所述方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述左TALE結合多肽和右TALE結合多肽包含來自SEQ?ID?NO:270的約11個氨基酸或約40個氨基酸的C-末端結構域。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中x為2至5，優選為3至5。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述N末端分裂DddAtox和/或所述C末端分裂DddAtox的序列包含至少一種突變，所述突變降低所述分裂DddAtox彼此之間的親和力。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述突變被引入到SEQ?ID?NO:29的所述C末端分裂DddAtox中。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述左TALE結合多肽和右TALE結合多肽包含選自SEQ?ID?NO:12至15的規范序列的AvrBs3-樣重復體。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述左TALE結合多肽和右TALE結合多肽包含
8.根據權利要求7所述的方法，其中至少一個所述AvrBs3-樣重復體包含選自由以下組成的組中的一個多肽序列：
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述TALE結合多肽的C末端結構域由具有40至80個殘基的多肽序列組成，所述多肽序列與以下具有至少85％的同一性：
10.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，還包括以下步驟：在細胞中表達在步驟iv)中得到的編碼所述TALE堿基編輯器異二聚體的多核苷酸，優選將突變引入到治療性免疫細胞中。
11.一種用于將突變引入細胞的基因組的方法，包括以下步驟：向所述細胞中引入或表達TALE堿基編輯器，所述TALE堿基編輯器由具有約1至50個氨基酸的C末端結構域的左TALE結合多肽和右TALE結合多肽分別與C末端和N末端分裂DddATox的異二聚體融合物組成，其中異二聚體TALE堿基編輯器結合選自以下的基因組序列：
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述左TALE結合多肽和右TALE結合多肽具有1至50個氨基酸、優選8至40個氨基酸、更優選10至30個氨基酸的C-末端結構域。
13.根據權利要求11所述的方法，其中所述左TALE結合多肽和右TALE結合多肽具有約11或40個氨基酸的C末端結構域。
14.根據權利要求11至13中任一項所述的方法，其中x為2至5，優選為3至5。
15.根據權利要求11至14中任一項所述的方法，其中所述細胞是造血干細胞。
16.根據權利要求11至14中任一項所述的方法，其中所述細胞是免疫細胞。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述免疫細胞是原代細胞。
18.根據權利要求16或17所述的方法，其中所述免疫細胞是T細胞或NK細胞。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述T細胞中TCR的表達被抑制或失活。
20.根據權利要求11至19中任一項所述的方法，其中免疫細胞被賦予嵌合抗原受體(CAR)或重組TCR。
21.根據權利要求11至20中任一項所述的方法，其中所述TALE堿基編輯器結合編碼TRAC的基因中包含的基因組序列。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述TALE堿基編輯器結合選自SEQ?ID?NO:366至SEQ?ID?NO:407中任一個的基因組序列。
23.根據權利要求11至20中任一項所述的方法，其中所述TALE堿基編輯器結合編碼用于免疫抑制藥物的靶標的基因中包含的基因組序列。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述TALE堿基編輯器結合編碼CD52的基因中包含的基因組序列。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述TALE堿基編輯器結合選自SEQ?ID?NO:408至SEQ?ID?NO:422中任一個的基因組序列。
26.根據權利要求11至20中任一項所述的方法，其中所述TALE堿基編輯器結合編碼免疫檢查點的基因中包含的基因組序列。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述TALE堿基編輯器結合選自SEQ?ID?NO:423至SEQ?ID?NO:466中任一個的PD1基因中的基因組序列。
28.根據權利要求11至20中任一項所述的方法，其中所述TALE堿基編輯器結合編碼B...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.用于在雙鏈核酸序列中設計和生產tale堿基編輯器異二聚體以將特定的c轉化為a和/或將c互補的g位置轉化為t的方法，所述方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述左tale結合多肽和右tale結合多肽包含來自seq?id?no:270的約11個氨基酸或約40個氨基酸的c-末端結構域。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中x為2至5，優選為3至5。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述n末端分裂dddatox和/或所述c末端分裂dddatox的序列包含至少一種突變，所述突變降低所述分裂dddatox彼此之間的親和力。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述突變被引入到seq?id?no:29的所述c末端分裂dddatox中。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述左tale結合多肽和右tale結合多肽包含選自seq?id?no:12至15的規范序列的avrbs3-樣重復體。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述左tale結合多肽和右tale結合多肽包含avrbs3-樣重復體，相對于avrbs3的規范序列的任一個，所述avrbs3-樣重復體在位置4和32處包含d(天冬氨酸)殘基。
8.根據權利要求7所述的方法，其中至少一個所述avrbs3-樣重復體包含選自由以下組成的組中的一個多肽序列：
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述tale結合多肽的c末端結構域由具有40至80個殘基的多肽序列組成，所述多肽序列與以下具有至少85％的同一性：
10.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，還包括以下步驟：在細胞中表達在步驟iv)中得到的編碼所述tale堿基編輯器異二聚體的多核苷酸，優選將突變引入到治療性免疫細胞中。
11.一種用于將突變引入細胞的基因組的方法，包括以下步驟：向所述細胞中引入或表達tale堿基編輯器，所述tale堿基編輯器由具有約1至50個氨基酸的c末端結構域的左tale結合多肽和右tale結合多肽分別與c末端和n末端分裂dddatox的異二聚體融合物組成，其中異二聚體tale堿基編輯器結合選自以下的基因組序列：
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述左tale結合多肽和右tale結合多肽具有1至50個氨基酸、優選8至40個氨基酸、更優選10至30個氨基酸的c-末端結構域。
13.根據權利要求11所述的方法，其中所述左tale結合多肽和右tale結合多肽具有約11或40個氨基酸的c末端結構域。
14.根據權利要求11至13中任一項所述的方法，其中x為2至5，優選為3至5。
15.根據權利要求11至14中任一項所述的方法，其中所述細胞是造血干細胞。
16.根據權...
【專利技術屬性】
技術研發人員：亞歷山大·朱耶拉特，楊明，亞歷克斯·博伊恩，瑪麗亞·費奧拉，朱利安·瓦爾頓，
申請(專利權)人：塞勒克提斯公司，
類型：發明
國別省市：
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