本發明專利技術提供了一種抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段、試劑盒及其應用。本發明專利技術采用流式細胞儀分選單個B細胞，成功篩選出抗植酸酶特異性抗體。將篩選得到的重組抗體使用ELISA方法進行功能驗證，驗證其具有與植酸酶抗原的特異性結合能力。這些重組抗體活性高、穩定性好，且具有較強的特異性，能作為定性檢測植酸酶陽性的參考標準。
1、傳統雜交瘤自然篩選的抗體分子具有優勢，但平臺效率低。單細胞光導系統成本昂貴。噬菌體展示、酵母展示和哺乳動物細胞展示等蛋白展示技術避免了融合雜交瘤不穩定和反復亞克隆等缺點，被廣泛應用于重組抗體的篩選和制備，為單克隆抗體的發展提供了廣闊的空間。但在大多數展示系統中，構建的抗體文庫是重鏈和輕鏈基因的隨機組合，因此篩選到重輕鏈原始配對的特異性較高的抗體有較大難度。
2、目前廣泛流行的分離單個b細胞的方法是流式細胞熒光分選技術（facs），可以分離出抗原特異性的b細胞，這是一種基于流式細胞儀，通過熒光素標記識別特定分子的蛋白，檢測b細胞表面的特定分子來篩出單個b細胞的一種廣泛應用的技術，它的原理也可以認為是抗原抗體的特異性結合。這種方法保留了輕重鏈可變區的天然配對，具有基因多樣性好、效率高、需要的細胞量少等優勢，是最新、最高效的抗體篩選方法之一。
3、植酸酶是一種能夠催化植酸（也稱為肌醇六磷酸）水解的酶，是一種胞外酶，廣泛存在于自然界中，在動物、植物、微生物體內均有發現。在多種植物（如谷物、豆類、蔬菜）組織,特別是萌發的種子和花粉中都發現了植酸酶。此外，自然界中產植酸酶的微生物種類繁多,如細菌、霉菌、真菌等。植酸酶能將磷酸殘基從植酸上水解下來，從而破壞植酸對礦物元素強烈的親和力，故植酸酶能增加礦物元素的營養效價。但目前公開的針對植酸酶的檢測抗體比較少。
>1、本專利技術的目的是提供一種抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，具有對植酸酶的高親和力。2、本專利技術采用的技術方案為：
3、一種抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其包括如下a1或a2所述的蛋白質：
4、a1：該單克隆抗體的重鏈cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，cdr2的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；輕鏈cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.4所示，cdr2的氨基酸序列為如seq?id?no.5，cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.6所示；
5、a2：該單克隆抗體的重鏈cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，cdr2的氨基酸序列如seq?id?no.8所示，cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.9所示；輕鏈cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.10所示，cdr2的氨基酸序列為如seq?id?no.11，cdr3的氨基酸序列如seq?idno.12所示。
6、優選的，其包括如下b1或b2所述的蛋白質：
7、b1：該單克隆抗體的重鏈可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.13所示的序列；或與seqid?no.13有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列，該單克隆抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.14所示的序列；或與seqid?no.14有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列；
8、b2：該單克隆抗體的重鏈可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.15所示的序列；或與seqid?no.15有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列，該單克隆抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.16所示的序列；或與seqid?no.16有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列。
9、在本專利技術中b1中的單克隆抗體的重鏈可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.13所示的序列，其中包括了該重鏈可變區的高度可變區（cdrs）和框架區，其中框架區可以與seqid?no.13所示的序列中對應框架區具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%以上的序列同一性。b1中的單克隆抗體的輕鏈可變區的框架區可以與seq?id?no.14所示的序列中對應的框架區具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%以上的序列同一性。b2中的單克隆抗體的重鏈可變區的框架區可以與seq?id?no.15所示的序列中對應的框架區具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%以上的序列同一性。b2中的單克隆抗體的輕鏈可變區的框架區可以與seq?id?no.16所示的序列中對應的框架區具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%以上的序列同一性。
10、優選的，所述單克隆抗體或其抗原結合片段還包括恒定區。
11、優選的，所述恒定區包括重鏈恒定區和輕鏈恒定區；所述恒定區選自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd的恒定區。
12、優選的，所述抗體來源為牛、馬、豬、綿羊、山羊、大鼠、小鼠、兔、雞、鴨或人，更優選為小鼠。
13、上述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段的編碼基因。
14、上述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段的表達載體或者宿主菌。
15、上述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段在檢測植酸酶含量中的應用。這里的含量并不限定為絕對含量，還包括相對含量，以及反應出含有植酸酶的情形等（例如陽性反應）。
16、本專利技術還公開了一種抗體偶聯物，所述抗體偶聯物包括上述的單克隆抗體或其抗原結合片段。
17、優選的，所述單克隆抗體或其抗原結合片段偶聯至生物素或標記物。標記物選自熒光染料、酶、放射性同位素、化學發光試劑或納米顆粒類標記物等。更優選地，所述單克隆抗體或其抗原結合片段偶聯至生物素。
18、本專利技術還公開了一種試劑盒，含有上述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段或抗體偶聯物。
19、優選的，該試劑盒為免疫熒光檢測試劑盒、免疫組織化學檢測試劑盒、流式細胞術檢測試劑盒、蛋白免疫印跡檢測試劑盒或elisa檢測試劑盒。
20、本專利技術還公開了一種檢測樣本中植酸酶含量的方法，以a1或b1所述的單克隆抗體為包被抗體，以a2或b2所述的單克隆抗體為檢測抗體，采用elisa法進行檢測。在本專利技術的一些實施例中，以b1所述的單克隆抗體為包被抗體，以b2所述的單克隆抗體為檢測抗體，采用elisa法進行檢測。在本專利技術的一些實施例中，以b2所述的單克隆抗體為檢測抗體時，b2所述的單克隆抗體偶聯至生物素。
21、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可以通過本領域已知的任何方法計算百分比序列同一性，例如使用?blosum62?matrix，參照henikoff等人在p
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【技術保護點】
1.一種抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其特征在于，其重鏈CDR1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQID?NO.3所示；輕鏈CDR1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，CDR2的氨基酸序列為如SEQ?IDNO.5，CDR3的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。
2.根據權利要求1所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其特征在于：其重鏈可變區的氨基酸序列包括SEQ?ID?NO.13所示的序列，或與SEQID?NO.13有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列；其輕鏈可變區的氨基酸序列包括SEQ?ID?NO.14所示的序列，或與SEQID?NO.14有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其抗原結合片段還包括恒定區。
4.根據權利要求3所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述恒定區包括重鏈恒定區和輕鏈恒定區；所述恒定區選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的恒定區。
5.權利要求1-4中任一項所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段的編碼基因。
6.權利要求1-4中任一項所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段的表達載體或者宿主菌。
7.一種抗體偶聯物，其特征在于，所述抗體偶聯物包括權利要求1-4任一項所述的單克隆抗體或其抗原結合片段。
8.根據權利要求7所述的抗體偶聯物，其特征在于，所述單克隆抗體或其抗原結合片段偶聯至生物素或標記物。
9.一種試劑盒，其特征在于含有權利要求1-4中任一項所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段或權利要求7或8中任一項所述的抗體偶聯物。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于還含有另一抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其重鏈CDR1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ?IDNO.8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.9所示；輕鏈CDR1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所示，CDR2的氨基酸序列為如SEQ?ID?NO.11，CDR3的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.12所示。
11.根據權利要求10所述的試劑盒，其特征在于另一抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區的氨基酸序列包括SEQ?ID?NO.15所示的序列，或與SEQID?NO.15有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列；其輕鏈可變區的氨基酸序列包括SEQ?ID?NO.16所示的序列，或與SEQID?NO.16有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列。
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【技術特征摘要】
1.一種抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其特征在于，其重鏈cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，cdr2的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，cdr3的氨基酸序列如seqid?no.3所示；輕鏈cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.4所示，cdr2的氨基酸序列為如seq?idno.5，cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.6所示。
2.根據權利要求1所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其特征在于：其重鏈可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.13所示的序列，或與seqid?no.13有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列；其輕鏈可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.14所示的序列，或與seqid?no.14有至少80%、85%、90%或95%以上的序列同一性、且與植酸酶親和力相同或相近的氨基酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述單克隆抗體或其抗原結合片段還包括恒定區。
4.根據權利要求3所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段，其特征在于，所述恒定區包括重鏈恒定區和輕鏈恒定區；所述恒定區選自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd的恒定區。
5.權利要求1-4中任一項所述的抗植酸酶單克隆抗體或其抗原結合片段的編碼基因。
6.權利要求1-4中任一項所述的抗植酸酶...
【專利技術屬性】
技術研發人員：易紅飛，張潔，
申請(專利權)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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