【技術實現步驟摘要】
本公開涉及用于使用適體來選擇性捕獲在免疫球蛋白中發現的或包含在人源化單克隆抗體內的人fc結構域的方法和試劑盒。更具體地，本技術涉及適體配體的經改善的選擇性和結合，以更有效地捕獲在免疫球蛋白中發現的人fc結構域。
技術介紹
1、在過去的幾十年內，免疫療法的市場已指數性生長。直至2018年，超過80種抗體治療劑已經被fda批準，并且數百個候選者經歷臨床試驗。人單克隆抗體(mab)表示最常用的抗體治療方式中的一者，并且提供顯著減小的免疫原性風險。約80％的fda批準的抗體藥物是具有超過90％人序列起源的完全人或人源化抗體。為了跟上對人抗體治療劑需求的這種快速增長，需要高通量、選擇性純化來自細胞培養和生物流體樣本的靶蛋白。
技術實現思路
1、需要方法和試劑盒，其使用適體來選擇性捕獲在免疫球蛋白中發現的或包含在人源化單克隆抗體內的人fc結構域的方法和試劑盒。由于對人抗體治療劑需求的快速增長，因此本技術的方法高通量和選擇性純化來自細胞培養和生物流體樣本的靶蛋白。本技術是穩健的并且有利于人fc捕獲，能夠在藥代動力學、藥效動力學和生物轉化研究期間執行詳細且準確的分析。
2、令人驚訝地發現，在用于將適體結合到基底的結合緩沖液中的一價與二價陽離子之間存在競爭作用，以及令人驚訝的發現，即結合緩沖液易受不同陽離子的影響。這些令人驚訝的發現導致常見的緩沖液被從本方法中排除，如下文所詳述。本技術的一個益處是，復合基質(例如，生物流體)可以在其一價陽離子濃度下被還原，并且內源性一價離子的負面影響被最
3、在一個方面，本技術涉及一種捕獲生物流體樣本中的人免疫球蛋白fc結構域的方法。該方法包括提供親和捕獲裝置，該親和捕獲裝置包括具有適體的表面，該適體固定到親和捕獲裝置的表面上并與seq?id?no?1至少80％相同。該方法還包括用結合緩沖液來稀釋生物流體樣本。結合緩沖液包括(a)三(羥基甲基)氨基甲烷(tris)、三甲胺(tes)、2-乙磺酸(mes)或4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)；(b)濃度介于約10μm至約20mm之間的鎂陽離子；和(c)0至不大于100mm的總一價陽離子濃度。用結合緩沖液將生物流體樣本中的人免疫球蛋白fc結構域吸附到適體。seq?id?no?1如下所示。該方法可包括本文所述的實施方案中的一個或多個。
4、seq?id?no?1：
5、5'末端-g?grargrg[i2fu]rg?c[i2fu]c?c?gaaargrgaa[i2fc][i2fu]c?c–3'末端
6、其中a、c、g、u表示四個核堿基。大寫字母對應于脫氧核糖核苷酸，并且rx指示核糖核苷酸。[i2fc]和[i2fu]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
7、在另一方面，本技術涉及一種捕獲生物流體樣本中的人免疫球蛋白fc結構域的方法。該方法包括提供親和捕獲裝置，該親和捕獲裝置包括具有適體的表面，該適體固定到親和捕獲裝置的表面上并與seq?id?no?2至少80％相同。該方法還包括用結合緩沖液來稀釋生物流體樣本。結合緩沖液包括(a)三(羥基甲基)氨基甲烷(tris)、三甲胺(tes)、2-乙磺酸(mes)或4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)；(b)濃度介于約10μm至約20mm之間的鎂陽離子；和(c)0至不大于100mm的總一價陽離子濃度。用結合緩沖液將生物流體樣本中的人免疫球蛋白fc結構域吸附到適體。seq?id?no?2如下所示。該方法可包括本文所述的實施方案中的一個或多個。
8、seq?id?no?2：
9、5'末端–g?grargrg[i2fu]rg[i2fc][i2fu][i2fc][i2fc]gaaargrg?ra?ra[i2fc][i2fu]c?c–3'末端
10、其中a、c、g、u表示四個核堿基。大寫字母對應于脫氧核糖核苷酸，并且rx指示核糖核苷酸。[i2fc]和[i2fu]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
11、在另一方面，本技術涉及一種捕獲生物流體樣本中的人免疫球蛋白fc結構域的方法。該方法包括提供親和捕獲裝置，該親和捕獲裝置包括具有適體的表面，該適體固定到親和捕獲裝置的表面上并與seq?id?no?3至少80％相同。該方法還包括用結合緩沖液來稀釋生物流體樣本。結合緩沖液包括(a)三(羥基甲基)氨基甲烷(tris)、三甲胺(tes)、2-乙磺酸(mes)或4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)；(b)濃度介于約10μm至約20mm之間的鎂陽離子；和(c)0至不大于100mm的總一價陽離子濃度。用結合緩沖液將生物流體樣本中的人免疫球蛋白fc結構域吸附到適體。seq?id?no?3如下所示。該方法可包括本文所述的實施方案中的一個或多個。
12、seq?id?no?3：
13、5'末端–g?g?ra?rg?rg[i2fu]rg[i2fc][i2fu][i2fc]c?g?a?a?a?rg?rg?ra?ra[i2fc][i2fu]c?c–3'末端
14、其中a、c、g、u表示四個核堿基。大寫字母對應于脫氧核糖核苷酸，并且rx指示核糖核苷酸。[i2fc]和[i2fu]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸
15、在另一方面，本技術涉及一種捕獲生物流體樣本中的人免疫球蛋白fc結構域的方法。該方法包括提供親和捕獲裝置，該親和捕獲裝置包括具有適體的表面，該適體固定到親和捕獲裝置的表面上并與seq?id?no?4至少80％相同。該方法還包括用結合緩沖液來稀釋生物流體樣本。結合緩沖液包括(a)三(羥基甲基)氨基甲烷(tris)、三甲胺(tes)、2-乙磺酸(mes)或4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)；(b)濃度介于約10μm至約20mm之間的鎂陽離子；和(c)0至不大于100mm的總一價陽離子濃度。用結合緩沖液將生物流體樣本中的人免疫球蛋白fc結構域吸附到適體。seq?id?no?4如下所示。該方法可包括本文所述的實施方案中的一個或多個。
16、seq?id?no?4：
17、5'末端–g(ome)g(ome)ra?rg?rg[i2fu]rg[i2fc][i2fu][i2fc][i2fc]g(ome)a(ome)a(ome)a(ome)rgrgrara[i2fc][i2fu]c(ome)c(ome)–3'末端
18、其中a、c、g、u表示四個核堿基。大寫字母對應于脫氧核糖核苷酸，并且rx指示核糖核苷酸。[i2fc]和[i2fu]代表2'-氟取代的嘧啶核苷酸。c(ome)、g(ome)和a(ome)表示2'-甲氧基取代的核苷酸。
19、在另一方面，本技術涉及一種捕獲生物流體樣本中的人免疫球蛋白fc結構域的方法。該方法包括提供親和捕獲裝置，該親和捕獲裝置包括具有適體的表面，該適體固定到親和捕獲裝置的表面上并與seq?id?no?5至少80％相同。該方法還包括用結本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種捕獲生物流體樣本中存在的人Fc結構域的方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述適體是23個核苷酸的適體。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述適體具有凸起基序和環結構。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述適體非共價地固定到所述親和捕獲裝置的所述表面上。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述結合緩沖液具有小于約50mM的一價陽離子濃度。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述結合緩沖液具有小于約30mM的一價陽離子濃度。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述結合緩沖液的pH介于約5與約9之間。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述結合緩沖液的pH介于約6至約8之間。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述結合緩沖液的pH為約7.2。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本以系數2被稀釋。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本以系數10被稀釋。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所述
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本被稀釋以獲得不大于100mM的所述生物流體樣本的總一價陽離子濃度。
14.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本被稀釋以獲得不大于50mM的所述生物流體樣本的總一價陽離子濃度。
15.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本被稀釋以獲得不大于30mM的所述生物流體樣本的總一價陽離子濃度。
16.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，還包括使用洗脫液從經固定的適體洗脫吸附的人免疫球蛋白Fc結構域，所述洗脫液具有介于約10mM至約1000mM之間的銨濃度。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述銨以四甲基銨、三乙基銨、甲酸銨或醋酸銨的形式呈現。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述銨濃度介于約50mM至約500mM之間。
19.根據權利要求16所述的方法，其中所述洗脫液具有介于約6.5至約8.0之間的pH。
20.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，還包括用所述結合緩沖液來洗滌所述吸附的人免疫球蛋白Fc結構域。
21.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，還包括用包含Ca+的緩沖液來洗滌所述吸附的人免疫球蛋白Fc結構域。
22.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，其中所述鎂陽離子的濃度介于約50mM至約1mM之間。
23.根據權利要求16所述的方法，還包括用檢測器來分析洗脫的人免疫球蛋白Fc結構域。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述檢測器為夾心酶聯免疫吸附測定。
25.根據權利要求23所述的方法，其中所述檢測器為質譜儀。
26.一種試劑盒，所述試劑盒包括：
27.根據權利要求26所述的試劑盒，其中所述適體是23個核苷酸的適體。
28.根據權利要求26所述的試劑盒，其中所述適體具有凸起基序和環結構。
29.根據權利要求26所述的試劑盒，其中所述結合緩沖液具有小于約50mM的一價陽離子濃度。
30.根據權利要求26所述的試劑盒，其中所述結合緩沖液具有小于約30mM的一價陽離子濃度。
31.根據權利要求26所述的試劑盒，其中所述結合緩沖液的pH介于約5與約9之間。
32.根據權利要求31所述的試劑盒，其中所述結合緩沖液的pH介于約6至約8之間。
33.根據權利要求32所述的試劑盒，其中所述結合緩沖液的pH為約7.2。
34.根據權利要求26所述的試劑盒，其中所述鎂陽離子的濃度介于約50mM至約1mM之間。
35.根據權利要求26至34中任一項所述的試劑盒，還包括瓶裝洗脫液，所述洗脫液具有介于約10mM至約1000mM之間的銨濃度。
36.根據權利要求35所述的試劑盒，其中所述銨以四甲基銨、三乙基銨、甲酸銨或醋酸銨的形式呈現。
37.根據權利要求26至34中任一項所述的試劑盒，還包括包含Ca+的瓶裝緩沖液。
38.根據權利要求37所述的試劑盒，其中所述緩沖液被濃縮，并且所述試劑盒還包括用于使用水將所述濃縮緩沖液稀釋至工作濃度的說明書。
39.根據權利要求36所述的試劑盒，還包括用于執行根據權利要求1所述的方法的說明書。
40.一種捕獲生物流體樣本中存在的人Fc結構域的方法，所述方法包括：
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【技術特征摘要】
1.一種捕獲生物流體樣本中存在的人fc結構域的方法，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述適體是23個核苷酸的適體。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述適體具有凸起基序和環結構。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述適體非共價地固定到所述親和捕獲裝置的所述表面上。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述結合緩沖液具有小于約50mm的一價陽離子濃度。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述結合緩沖液具有小于約30mm的一價陽離子濃度。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述結合緩沖液的ph介于約5與約9之間。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述結合緩沖液的ph介于約6至約8之間。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述結合緩沖液的ph為約7.2。
10.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本以系數2被稀釋。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本以系數10被稀釋。
12.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本以系數20被稀釋。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本被稀釋以獲得不大于100mm的所述生物流體樣本的總一價陽離子濃度。
14.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本被稀釋以獲得不大于50mm的所述生物流體樣本的總一價陽離子濃度。
15.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物流體樣本被稀釋以獲得不大于30mm的所述生物流體樣本的總一價陽離子濃度。
16.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，還包括使用洗脫液從經固定的適體洗脫吸附的人免疫球蛋白fc結構域，所述洗脫液具有介于約10mm至約1000mm之間的銨濃度。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述銨以四甲基銨、三乙基銨、甲酸銨或醋酸銨的形式呈現。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述銨濃度介于約50mm至約500mm之間。
19.根據權利要求16所述的方法，其中所述洗脫液具有介于約6.5至約8.0之間的ph。
20.根據權利要求1至15中任一項所述的方法，還包括用所述結合緩沖液來洗滌所述吸附的人免疫球蛋白fc結構域。
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