【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及病毒遺傳操作，更具體的說是涉及一種禽腺病毒4型的反向遺傳操作系統及其應用。
技術介紹
1、禽腺病毒4型(fowladenovirus，fadv-4)屬于腺病毒科(adenoviridae)禽腺病毒屬(aviadenovirus)成員，為無囊膜的雙股dna病毒，主要感染3～6周齡雞，可引起嚴重的肝炎-心包積液綜合征(hepatitis-hydropericardium?syndrome，hhs)，死亡率高達80％～90％，對養禽業造成了巨大的經濟損失。雖然國內外研究人員對fadv-4在生物學特性、致病機理、診斷試劑和疫苗研究等方面做了一些工作，但是，目前仍然缺乏有效的防控手段。因此，明確fadv-4的致病機制及研制安全有效的新型疫苗對于fadv-4的基礎研究和應用研究均具有重要意義。
2、fadv-4基因組龐大，長約43～46kb，很難對其基因組進行操作和修飾。反向遺傳操作系統平臺是研究fadv-4病毒基因功能、致病機制及新型疫苗的關鍵工具，同時利用反向遺傳操作技術將外源標簽插入病毒基因組可以用來研究病毒的復制、病毒編碼蛋白的功能及抗病毒藥物的篩選等。然而，目前國內外只有少數實驗室構建了fadv-4的反向遺傳操作系統平臺，對于該系統的應用尚處于起步階段。此外，現有fadv-4感染性克隆構建方法在后期改造病毒時，需要redα/β重組系統對其進行改造，此方法需要兩次克隆才能將目的基因插入病毒基因組中，操作過程較為繁瑣，進一步增加了基因組突變的風險。
3、綜上，如何提供一種高效便捷的禽腺病毒4型反向
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術提供了一種禽腺病毒4型的反向遺傳操作系統及其應用。
2、為進一步建立更加高效便捷的反向遺傳操作系統，本專利技術以fadv-4/y17215-1為研究對象，將其分為a，b，c和d四個片段，利用同源重組技術分別連接至pok-cmv載體，成功構建覆蓋全基因組的四個文庫質粒并能成功拯救出病毒。同時，為驗證該構建策略是否能快速對病毒進行改造及插入外源基因等，利用同源重組技術將nanoluc報告基因插入禽腺病毒4型基因組的orf42與orf43之間，成功拯救出表達nanoluc報告基因的重組fadv-4。
3、為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
4、一種禽腺病毒4型的反向遺傳操作系統，包括分別含有禽腺病毒4型基因組1～10990nt，10492～21968nt，21703～32894nt和32708～43720nt核苷酸序列的4個重組粘粒，所述禽腺病毒4型全基因組的genebank登錄號為pq539419。
5、進一步的，所述4個重組粘粒是通過將禽腺病毒4型基因組1～10990nt，10492～21968nt，21703～32894nt和32708～43720nt核苷酸序列分別與pok-cmv載體連接后得到的；
6、所述pok-cmv載體的構建方法為：依次連接cmv啟動子、丁型肝炎病毒核酶hdvrz和polya終止子序列，并將該片段與pok12載體進行同源重組，得到pok-cmv載體。
7、進一步的，還包括宿主細胞，禽腺病毒4型能夠在該宿主細胞內復制許可。
8、進一步的，所述宿主細胞為lmh細胞。
9、一種構建禽腺病毒4型的反向遺傳操作系統的方法，包括如下步驟：
10、(1)以禽腺病毒4型全長基因組為骨架，通過pcr擴增獲得四個dna片段，所用引物如下：
11、af：gtctcatcattttggcaaacatcatcttatataaccgcgtcttt?tgacac，seq?id?no.1；
12、ar：ggagatgccatgccgaccctccgatttctactccgtagacgtc?atcg，seq?id?no.2；
13、bf：gtctcatcattttggcaaaggtgattttggttccacagttgttt?ttg，seq?id?no.3；
14、br：ggagatgccatgccgacccaggtttttgatggcgaagaatttt?tggg，seq?id?no.4；
15、cf：gtctcatcattttggcaaattacaagtttagcatctccggcttc?gac，seq?id?no.5；
16、cr：ggagatgccatgccgacccttcatagtatccattggccgagta?cgtcc，seq?id?no.6；
17、df：gtctcatcattttggcaaatacctccctctacttgaaattggac?agc，seq?id?no.7；
18、dr：ggagatgccatgccgaccccatcatcttatataaccgcgtctt?ttgacac，seq?id?no.8；
19、(2)依次連接cmv啟動子、丁型肝炎病毒核酶hdvrz和polya終止子序列，并將該片段與pok12載體進行同源重組，得到pok-cmv載體；
20、(3)利用同源重組技術將四個dna片段分別克隆至pok-cmv載體，得到四個文庫質粒，命名為pokcmv-a，pokcmv-b，pokcmv-c，pokcmv-d；
21、(4)將pokcmv-a，pokcmv-b，pokcmv-c，pokcmv-d共轉染到lmh細胞中，進行病毒拯救。
22、進一步的，所述步驟(3)中，cmv啟動子和丁型肝炎病毒核酶hdvrz之間保留ecor?i酶切位點。
23、上述的反向遺傳操作系統的應用，是將反向遺傳操作系統用于拯救禽腺病毒4型。
24、上述的反向遺傳操作系統的應用，是將反向遺傳操作系統用于構建禽腺病毒4型突變體或對禽腺病毒4型基因組進行修飾。
25、上述的反向遺傳操作系統的應用，是將反向遺傳操作系統用于制備重組疫苗。
26、經由上述的技術方案可知，與現有技術相比，本專利技術取得的有益效果為：
27、本專利技術首次采用禽腺病毒4型基因組分段擴增方法獲得四個文庫質粒，在感染細胞后第一代出現病變，拯救效率高，并且所采用的構建方法可直接進行基因的缺失、替換和插入，不需要redα/β重組系統，構建效率更快速便捷，為深入開展fadv-4的基礎和應用研究提供了高效的技術平臺，具有重要的科學應用價值。
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1.一種禽腺病毒4型的反向遺傳操作系統，其特征在于，包括分別含有禽腺病毒4型基因組1～10990nt，10492～21968nt，21703～32894nt和32708～43720nt核苷酸序列的4個重組粘粒，所述禽腺病毒4型全基因組的GeneBank登錄號為PQ539419。
2.如權利要求1所述的反向遺傳操作系統，其特征在于，所述4個重組粘粒是通過將禽腺病毒4型基因組1～10990nt，10492～21968nt，21703～32894nt和32708～43720nt核苷酸序列分別與pOK-CMV載體連接后得到的；
3.如權利要求1～2任一所述的反向遺傳操作系統，其特征在于，還包括宿主細胞，禽腺病毒4型能夠在該宿主細胞內復制許可。
4.如權利要求3所述的反向遺傳操作系統，其特征在于，所述宿主細胞為LMH細胞。
5.一種構建禽腺病毒4型的反向遺傳操作系統的方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，CMV啟動子和丁型肝炎病毒核酶HdVRz之間保留EcoR?I酶切位點。p>
7.權利要求1～2任一所述的反向遺傳操作系統的應用，其特征在于，是將反向遺傳操作系統用于拯救禽腺病毒4型。
8.權利要求1～2任一所述的反向遺傳操作系統的應用，其特征在于，是將反向遺傳操作系統用于構建禽腺病毒4型突變體或對禽腺病毒4型基因組進行修飾。
9.權利要求1～2任一所述的反向遺傳操作系統的應用，其特征在于，是將反向遺傳操作系統用于制備重組疫苗。
...【技術特征摘要】
1.一種禽腺病毒4型的反向遺傳操作系統，其特征在于，包括分別含有禽腺病毒4型基因組1～10990nt，10492～21968nt，21703～32894nt和32708～43720nt核苷酸序列的4個重組粘粒，所述禽腺病毒4型全基因組的genebank登錄號為pq539419。
2.如權利要求1所述的反向遺傳操作系統，其特征在于，所述4個重組粘粒是通過將禽腺病毒4型基因組1～10990nt，10492～21968nt，21703～32894nt和32708～43720nt核苷酸序列分別與pok-cmv載體連接后得到的；
3.如權利要求1～2任一所述的反向遺傳操作系統，其特征在于，還包括宿主細胞，禽腺病毒4型能夠在該宿主細胞內復制許可。
4.如權利要...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭笑然，鄢明華，李程，李富強，董志民，王利麗，田向學，張莉，江珊，路超，
申請(專利權)人：天津市農業科學院，
類型：發明
國別省市：
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