【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因檢測領域，更具體地，本專利技術涉及一種用于胰腺導管腺癌(pdac)術后mrd檢測及動態監測的引物探針組合物、試劑盒及應用。
技術介紹
1、胰腺癌(pdac)是全球最具侵襲性的惡性腫瘤之一，其中胰腺導管腺癌（pdac）是最常見和最為致命的。手術切除聯合輔助全身化療目前是唯一的長期生存機會，但是大部分的患者在晚期被診斷出來，這使他們無法進行根治性手術，且大多數接受切除術的患者會在局部或遠處復發。pdac常見的檢測方法是影像學檢測包括造影增強計算機斷層掃描（ct）、磁共振成像（mri）和超聲內窺鏡（eus）等和ca19-9檢測。但是基于影像的傳統胰腺導管腺癌(pdac)檢測的挑戰包括高成本、侵入性以及靈敏度和特異性欠佳，這些方法使得不足以早期發現pdac及盡早發現復發。因此迫切需要更為精準的生物標志物和檢測方法，以更好地指導胰腺導管腺癌(pdac)的診療。
2、近年來，液體活檢受到高度關注，其中循環腫瘤dna（circulating?tumor?dna，ctdna）作為有價值的臨床生物標志物應用頗多。與腫瘤組織相比，血液中ctdna受腫瘤內異質性的影響較小。此外，ctdna?的半衰期短，可以作為實時腫瘤生物標志物動態反映腫瘤在特定時刻的狀態。同時，ctdna?攜帶與腫瘤相關的基因組信息，例如基因表達水平、突變和甲基化狀態等。與傳統的活檢標志物相比，ctdna是一種理想的生物標志物，尤其適用于治療效果的實時監測和預后評估。最近發現，ctdna可以作為準確評估實體瘤微小殘留病灶（minimal?residua
3、近年來，異常dna甲基化被認為是一種有前途的非侵入性癌癥檢測標志物。越來越多的證據表明，異常dna甲基化主要通過整體低甲基化、多個基因組區域（主要是cpg位點）的局灶性高甲基化和甲基化胞嘧啶的直接誘變來促進腫瘤發生和腫瘤進展。雖然已有部分針對胰腺導管腺癌(pdac)的甲基化生物標志物研究，但是對胰腺導管腺癌(pdac)血漿中甲基化生物標志物的探索仍處于早期階段，仍然需要更深入的探究。
4、因此仍然需要開發具有可接受的靈敏度和特異性以及成本低的胰腺導管腺癌(pdac)甲基化標志物檢測方法，并適合在大人群中快速檢測，同時對特定甲基化生物標志物與腫瘤進展之間調控機制的研究會更好的指正設計方向。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的不足，本專利技術提出了一種用于胰腺癌術后mrd檢測及動態監測的引物探針組合物、方法和試劑盒，在本專利技術中，通過檢測mir129-2基因啟動子區域甲基化，用于pdac術后mrd檢測及動態監測，通過檢測及臨床隨訪分析證實了mir129-2啟動子區域甲基化可以預測pdac的術后復發。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、一種用于胰腺癌術后mrd檢測及動態監測的引物探針組合物，包括：特異性檢測基因mir129-2啟動子甲基化區域和內參基因actb的特異性引物；
4、所述特異性檢測基因mir129-2啟動子甲基化區域的引物序列為：
5、mir129-2-f：ggagtggtgagattgagtc（seq?id?no:1）；
6、mir129-2-r：atctccgaaccctaaaaccg（seq?id?no:2）；
7、所述內參基因actb的特異性引物序列為：
8、actb-f：gtaatgttaggagtattttgtggata（seq?id?no:3）
9、actb-r：ctaacccaaaaaaacccaatccta（seq?id?no:4）。
10、作為本專利技術進一步的方案，所述特異性檢測基因mir129-2啟動子甲基化區域的熒光探針序列為：
11、mir129-2-p：cgatggaacgcgttggggagatt（seq?id?no:5）；
12、探針的5’端標記有熒光報告基團fam，3’端標記有熒光淬滅基團bhq1；
13、內參基因actb的特異性探針序列為：
14、actb-p：agaagaagggaggggtgttaggagagg（seq?id?no:6）；
15、探針的5’端標記有熒光報告基團cy5，3’端標記有熒光淬滅基團bhq2。
16、本專利技術所述的引物探針組合物用于擴增基因mir129-2啟動子區域的cpg位點富集區域。
17、本專利技術還提供了一種用于胰腺癌術后mrd檢測及動態監測的試劑盒，包括本專利技術中提到的引物探針組合物。
18、作為本專利技術進一步的方案，用于胰腺癌術后mrd檢測及動態監測的試劑盒，還包括本專利技術中提到的探針，進一步優選，還包括核酸提取試劑、核酸轉化試劑pcr?mix、陽性對照和陰性對照中的至少一種。
19、在本專利技術中，通過本專利技術試劑盒可檢測基因mir129-2啟動器區域甲基化狀態，基因mir129-2啟動子區域甲基化狀態可作為胰腺導管腺癌(pdac)術后mrd檢測及動態監測的標志物,?用于胰腺導管腺癌(pdac)術后患者的復發風險評估。本專利技術采用多重熒光定量pcr檢測方法，特異性和靈敏度高、重復性好，操作簡單，性能優于臨床使用胰腺導管腺癌(pdac)腫瘤標志物ca19-9；?在ca19-9陰性的患者中,?mir129-2基因啟動子區域甲基化仍然可以有效預測胰腺導管腺癌(pdac)患者術后復發.?本專利技術能幫助臨床醫生更加精準評估胰腺導管腺癌(pdac)術后復發風險，提高治療效果,?避免不必要的治療,?從而減少醫療成本。
20、本專利技術還提供了一種用于胰腺癌術后mrd一種用于胰腺癌術后mrd檢測及動態監測試劑盒制備中的應用，包括以下步驟：
21、步驟s1：核酸提取：提取外周血漿或組織的dna;
22、步驟s2：核酸轉化：將步驟s1的dna進行亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽或阱鹽處理并純化，獲得經修飾的待測樣本；
23、步驟s3：靶標擴增：利用本專利技術中的用于胰腺導管腺癌(pdac)術后mrd檢測及動態監測的試劑盒，對經修飾的待測樣本進行多重熒光定量pcr擴增；
24、步驟s4：結果判讀：同時檢測fam和cy5信號通道，通過讀取達到設定閾值時所需的循環次數ct值作為判斷標準。待測樣本cy5信號通道ct值小于31，待測樣本有效。在有效的前提下，fam信號通道ct值小于45，并且有典型的s型擴增曲線，待測本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于胰腺癌術后MRD檢測及動態監測的引物探針組合物，其特征在于，包括：特異性檢測基因mir129-2啟動子甲基化區域和內參基因ACTB的特異性引物；
2.如權利要求1所述的一種用于胰腺癌術后MRD檢測及動態監測的引物探針組合物，其特征在于，所述特異性檢測基因mir129-2啟動子甲基化區域的熒光探針序列為：
3.一種用于胰腺癌術后MRD檢測及動態監測的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物探針組合物。
4.如權利要求3所述的一種用于胰腺癌術后MRD檢測及動態監測的試劑盒，其特征在于，包括權利要求2所述的引物探針組合物。
5.如權利要求3所述的一種用于胰腺癌術后MRD檢測及動態監測的試劑盒，其特征在于，還包括核酸提取試劑、核酸轉化試劑PCR?MIX、陽性對照和陰性對照中的至少一種。
6.一種用于胰腺癌術后MRD檢測及動態監測試劑盒制備中的應用，其特征在于，包括以下步驟：
7.如權利要求6所述的一種用于胰腺癌術后MRD檢測及動態監測試劑盒制備中的應用，其特征在于，步驟S5中，參考樣本是人HCT116
...【技術特征摘要】
1.一種用于胰腺癌術后mrd檢測及動態監測的引物探針組合物，其特征在于，包括：特異性檢測基因mir129-2啟動子甲基化區域和內參基因actb的特異性引物；
2.如權利要求1所述的一種用于胰腺癌術后mrd檢測及動態監測的引物探針組合物，其特征在于，所述特異性檢測基因mir129-2啟動子甲基化區域的熒光探針序列為：
3.一種用于胰腺癌術后mrd檢測及動態監測的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物探針組合物。
4.如權利要求3所述的一種用于胰腺癌術后mrd檢測及動態監測的試劑盒，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王慧勇，潘小寶，王林，朱佳煒，
申請(專利權)人：慧算基因科技上海有限公司，
類型：發明
國別省市：
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