【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及天然產(chǎn)物藥物領(lǐng)域，尤其涉及草果黃酮的制備方法及其在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative?colitis，uc)是一種以周期性復(fù)發(fā)為特征的一種慢性炎癥性腸病，病變主要發(fā)生在直腸、結(jié)腸黏膜和黏膜下層。uc以反復(fù)腹痛腹瀉、黏液濃血便、體重嚴(yán)重減輕為主要臨床表現(xiàn)，病情輕重不一，常伴隨皮膚、肝膽、上消化道炎癥等疾病，長期的腸道炎癥狀態(tài)會(huì)增加結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。臨床上多以結(jié)腸鏡檢、影像學(xué)表現(xiàn)、炎癥指標(biāo)測定等評(píng)估uc疾病活動(dòng)度，根據(jù)疾病病變范圍及嚴(yán)重程度決定治療方案，病情輕微的患者無需免疫抑制或手術(shù)治療，而病情嚴(yán)重的患者需要通過手術(shù)切除結(jié)腸，后續(xù)仍有可能復(fù)發(fā)，患者需要承擔(dān)較高的時(shí)間成本以及經(jīng)濟(jì)損失。
2、草果(amomum?tsaoko?crevost?et?lemarie)為姜科豆蔻屬的一種多年生常綠叢生草本植物果實(shí)，屬于藥食兩用中藥材大宗品種之一。草果應(yīng)用歷史悠久，最早史載于明代《本草品匯精要》，并將草果列為草部上品，具有溫脾胃、止嘔吐、消宿食、逐腹中冷痛等功效，與其他藥材同煎能達(dá)到養(yǎng)胃清脾的作用。除藥用外，草果還可用作香辛料，常用其特殊的芳香味，達(dá)到去除腥味、提起食欲的作用。在大量草果功效研究數(shù)據(jù)中，未見其對(duì)炎癥性腸病改善作用的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供一種草果黃酮的制備方法及其在制備治療或改善結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。本專利技術(shù)通過提取純化得到草果黃酮，建立dss誘導(dǎo)uc小鼠模型，以揭示草果黃酮
2、為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：一種草果黃酮的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
3、步驟一：將草果干燥粉碎采用乙醇溶液浸泡，后超聲提取獲得黃酮粗提液；
4、步驟二：采用hpd300大孔樹脂層析柱對(duì)黃酮粗提液分離純化，以0-50％乙醇溶液梯度洗脫(純水開始洗脫，梯度依次遞增8-15％的乙醇濃度)，獲得15-35％乙醇洗脫的草果黃酮洗脫液，冷凍干燥制備得到草果黃酮粉。
5、作為優(yōu)選，步驟一中乙醇溶液濃度為55-65％，草果粉和乙醇溶液的料液比為1:35-1:40(w/v)，浸泡時(shí)間為10-15h，超聲功率為160-180w，超聲時(shí)間為40-50min，超聲溫度為65℃-70℃。
6、作為優(yōu)選，步驟二采用hpd300大孔樹脂層析柱分離純化時(shí)：吸附柱料比為1:15-25；上樣濃度為2.5-3.0mg/ml；上樣溶液ph為1.8-2.2；吸附溫度為20-25℃；洗脫流速1.4-1.6bv/h。
7、本專利技術(shù)還提供根據(jù)所述制備方法得到的草果黃酮。
8、本專利技術(shù)還提供所述草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。
9、作為對(duì)上述方案的進(jìn)一步描述：所述結(jié)腸炎為急性或慢性潰瘍性結(jié)腸炎。
10、作為對(duì)上述方案的進(jìn)一步描述：所述草果黃酮能顯著抑制結(jié)腸炎導(dǎo)致的體重顯著降低、降低dai評(píng)分、抑制結(jié)腸的縮短以及結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的破壞。
11、作為對(duì)上述方案的進(jìn)一步描述：在分子水平上，所述草果黃酮顯著抑制lps、tnf-α和il-1β含量的異常增加，顯著下調(diào)促炎因子tnf-α和il-1β的mrna表達(dá)水平，并有效改善f4/80、cd68、cd11b、cd14的過量表達(dá)引起的免疫紊亂，同時(shí)顯著上調(diào)腸道屏障因子zo-1、occludin和claudin4的mrna表達(dá)；所述草果黃酮能夠顯著下調(diào)tlr4、nf-κb、myd88、traf6、nlrp3、caspase-1的基因表達(dá)，從而抑制tlr4/nf-κb/nlrp3炎癥信號(hào)通路的激活。
12、作為對(duì)上述方案的進(jìn)一步描述：所述草果黃酮能夠顯著影響腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，促進(jìn)腸道菌群恢復(fù)，增加優(yōu)勢菌屬及減少有害菌屬。
13、作為對(duì)上述方案的進(jìn)一步描述：所述藥物是以所述草果黃酮為活性成分，單獨(dú)或與其他藥物組方，加入藥學(xué)上可接受的輔料、輔助性成分或載體制備成藥學(xué)上可接受的劑型。
14、本專利技術(shù)經(jīng)提取、分離純化工藝得到草果黃酮，對(duì)不同洗脫組分進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，并選用黃酮含量較高的洗脫組分開展抗結(jié)腸炎活性研究。主要研究結(jié)果如下：
15、(1)在單因素實(shí)驗(yàn)研究乙醇濃度、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間以及超聲溫度對(duì)草果黃酮得率影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用響應(yīng)面box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得最佳提取工藝條件。當(dāng)在乙醇濃度60％、料液比1:39(w/v)、超聲功率160w、超聲時(shí)間47min、超聲溫度69℃時(shí)，草果黃酮的得率達(dá)3.33％。
16、(2)草果黃酮純化工藝條件的獲得。首先，比較10種不同大孔樹脂吸附草果黃酮的吸附/解吸能力，篩選出x-5、hpd100、hpd300和hp-20大孔樹脂進(jìn)行準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、顆粒內(nèi)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模型擬合，并采用langmuir和freundlich方程探究這4種樹脂的吸附過程，確定hpd300是最佳樹脂。隨后，考察hpd300在不同上樣條件和洗脫條件下對(duì)草果黃酮含量的影響，在吸附時(shí)間8h、吸附溫度25℃、上樣濃度為2.79mg/ml、ph值為2、柱料比為1:20、洗脫流速為1.5bv/h、10％～50％乙醇洗脫條件下，得到黃酮含量較高的洗脫組分；其中，20％和30％乙醇洗脫所得草果黃酮含量超過90％。最后，采用植物廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)檢測了20％和30％洗脫組分的混合物(1:1混合)，發(fā)現(xiàn)其黃酮類化合物的相對(duì)豐度超過73％，主要含有表兒茶素(30.88％)、異槲皮苷(17.33％)、紫云英苷(9.52％)、山奈酚-3-o-蕓香糖苷(8.46％)、原花青素b2(6.82％)和蘆丁(5.65％)等物質(zhì)。
17、(3)草果黃酮提取物的體外抗氧化能力評(píng)價(jià)。通過測定10％、20％、30％、40％、50％乙醇洗脫組分的dpph、abts和oh－自由基清除率以及frap值，發(fā)現(xiàn)20％和30％乙醇洗脫組分的綜合抗氧化能力較強(qiáng)，而粗提物的抗氧化能力最弱，即抗氧化能力順序?yàn)?0％＞20％＞40％＞10％＞50％＞粗提物。
18、(4)草果黃酮的抗結(jié)腸炎活性評(píng)價(jià)和機(jī)制探究。在dss誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型(c57bl/6j)中系統(tǒng)的探究了草果黃酮(20％和30％乙醇洗脫所得草果黃酮1:1混合物)的抗結(jié)腸炎活性。發(fā)現(xiàn)：高劑量草果黃酮(100mg/kg)干預(yù)能顯著抑制dss誘導(dǎo)的uc小鼠體重的顯著降低、dai評(píng)分的升高、結(jié)腸長度的縮短以及結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)破壞等現(xiàn)象。在分子水平上，草果黃酮顯著抑制了dss誘導(dǎo)的uc小鼠血清lps、tnf-α和il-1β含量的異常增加(p＜0.05)，顯著下調(diào)uc小鼠結(jié)腸促炎因子tnf-α和il-1β的mrna表達(dá)水平(p＜0.05)，并有效改善uc小鼠結(jié)腸f4/80、cd68、cd11b、cd14的過量表達(dá)引起的免疫紊亂(p＜0.05)，同時(shí)顯著上調(diào)uc小鼠腸道屏障因子zo-1、occludin和claudin4的mrna表達(dá)(p＜0.05)；還發(fā)現(xiàn)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種草果黃酮的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草果黃酮的制備方法，其特征在于，步驟一中乙醇溶液濃度為55-65％，草果粉和乙醇溶液的料液比為1:35-1:40(w/v)，浸泡時(shí)間為10-15h，超聲功率為160-180W，超聲時(shí)間為40-50min，超聲溫度為65℃-70℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草果黃酮的制備方法，其特征在于，步驟二采用HPD300大孔樹脂層析柱分離純化時(shí)：吸附柱料比為1:15-25；上樣濃度為2.5-3.0mg/mL；上樣溶液pH為1.8-2.2；吸附溫度為20-25℃；洗脫流速1.4-1.6BV/h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法得到的草果黃酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述結(jié)腸炎為急性或慢性潰瘍性結(jié)腸炎。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述草果黃酮能顯著抑制結(jié)腸炎導(dǎo)致的
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，在分子水平上，所述草果黃酮顯著抑制LPS、TNF-α和IL-1β含量的異常增加，顯著下調(diào)促炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平，并有效改善F4/80、CD68、CD11b、CD14的過量表達(dá)引起的免疫紊亂，同時(shí)顯著上調(diào)腸道屏障因子ZO-1、Occludin和Claudin4的mRNA表達(dá)；所述草果黃酮能夠顯著下調(diào)TLR4、NF-κB、MyD88、TRAF6、NLRP3、Caspase-1的基因表達(dá)，從而抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎癥信號(hào)通路的激活。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述草果黃酮能夠顯著影響腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，促進(jìn)腸道菌群恢復(fù)，增加優(yōu)勢菌屬及減少有害菌屬。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物是以所述草果黃酮為活性成分，單獨(dú)或與其他藥物組方，加入藥學(xué)上可接受的輔料、輔助性成分或載體制備成藥學(xué)上可接受的劑型。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種草果黃酮的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草果黃酮的制備方法，其特征在于，步驟一中乙醇溶液濃度為55-65％，草果粉和乙醇溶液的料液比為1:35-1:40(w/v)，浸泡時(shí)間為10-15h，超聲功率為160-180w，超聲時(shí)間為40-50min，超聲溫度為65℃-70℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草果黃酮的制備方法，其特征在于，步驟二采用hpd300大孔樹脂層析柱分離純化時(shí)：吸附柱料比為1:15-25；上樣濃度為2.5-3.0mg/ml；上樣溶液ph為1.8-2.2；吸附溫度為20-25℃；洗脫流速1.4-1.6bv/h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法得到的草果黃酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述結(jié)腸炎為急性或慢性潰瘍性結(jié)腸炎。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的草果黃酮在制備治療結(jié)腸炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述草果黃酮能顯著抑制結(jié)腸炎導(dǎo)致的體重顯著降低、降...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：高曉余，黃澤琳，趙艷，田洋，彭磊，盛軍，
申請(專利權(quán))人：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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