【技術實現步驟摘要】
本申請涉及分子生物學，尤其涉及一種gadd34截短體及制備方法與應用。
技術介紹
1、蛋白質表達技術主要包括原核細胞表達、真核細胞表達和無細胞蛋白表達。其中原核細胞表達具有成本低廉的優勢，但許多蛋白質在原核細胞系統中無法得到有效表達；真核細胞表達具有效率高的優勢，但目前仍面臨成本高、表達周期較長的問題。相比于基于細胞的蛋白表達，無細胞蛋白表達(cfps)具有多個明顯的優勢，其表達周期短、產率高、能夠主動監測，并且不收細胞壁的限制，可以對蛋白表達的環境進行人為干預，是一種較為理想的，用于合成傳統方式難以表達和進行后續分析的蛋白的表達方法。
2、在無細胞蛋白表達的過程中，因為翻譯過程相對轉錄過程更加復雜，目前還不能通過僅加入固定的已知體系實現體外翻譯的過程，必須要加入細胞提取物(細胞裂解上清液)，其中含有翻譯必須的核糖體、rna聚合酶以及其他轉錄和翻譯輔助蛋白。而制作細胞裂解上清液的過程中，細胞不可避免的要進行物理破碎或化學裂解，引起細胞內的應激反應，導致eif2α的磷酸化，磷酸化的eif2α占據了eif2b與正常eif2α相互作用的位點，阻斷了eif2b介導的gdp與gtp的交換，從而阻止了翻譯起始復合物的形成，這導致無細胞蛋白表達效率降低。gadd34可以介導eif2α的磷酸化，但gadd34會被細胞快速降解。因此，現有技術還有待改進。
技術實現思路
1、鑒于上述現有技術的不足，本申請的目的在于提供一種gadd34截短體及制備方法和應用，旨在解決現有無細胞表達技術中由于
2、本申請的技術方案如下：
3、本申請的第一方面，提供一種gadd34截短體，所述gadd34截短體的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
4、本申請的第二方面，提供一種本申請第一方面的gadd34截短體的制備方法，所述gadd34截短體的制備方法為敲除所述gadd34的n端第1-240位氨基酸獲得gadd34截短體。
5、優選地，所述的gadd34截短體的制備方法，包括步驟：以野生型海拉細胞系的cdna文庫為模板，利用引物對進行pcr擴增，得到所述gadd34截短體的編碼基因；將所述gadd34截短體的編碼基因在物細胞中表達，獲得所述gadd34截短體。
6、優選地，所述引物對的核酸序列如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示。
7、本申請的第三方面，提供一種核酸，所述核酸包含權利要求1所述的gadd34截短體的編碼基因，所述gadd34截短體的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
8、本申請的第四方面，提供一種載體，所述載體包括本申請第三方面的核酸。
9、本申請的第五方面，提供一種瞬時表達gadd34截短體的細胞，將本申請第四方面的載體轉染至哺乳動物細胞中獲得。
10、本申請的第六方面，提供一種細胞裂解上清液，由本申請第五方面的瞬時表達gadd34截短體的細胞制備獲得。
11、本申請的第七方面，提供一種本申請第六方面的細胞裂解上清液的制備方法，包括步驟：獲取所述瞬時表達gadd34截短體的細胞，加入緩沖液重懸，在冰浴環境中破碎細胞，離心，使細胞破碎物沉淀，得到細胞裂解上清液；所述瞬時表達gadd34截短體的細胞和所述緩沖液的體積比為1：2。
12、本申請的第八方面，提供一種提供一種本申請第一方面的gadd34截短體在無細胞表達中的應用。
13、有申請的有益效果：本申請在保留了gadd34的核心基團的情況下，將gadd34進行截短，得到gadd34截短體，gadd34截短體在動物細胞中的半衰期比gadd34長。在制作細胞裂解上清液的過程中，細胞物理破碎或化學裂解使細胞處于應激反應，導致eif2α的磷酸化，磷酸化的eif2α占據了eif2b與正常eif2α相互左右的位點，阻斷了eif2b介導的gdp與gtp的交換，從而阻止了翻譯起始復合物的形成，導致翻譯活性降低。gadd34可以介導eif2α的磷酸化但gadd34會被細胞快速降解。gadd34截短體能夠增強或延長將磷酸化的翻譯起始因子去磷酸化的效果，進而提高細胞裂解上清液的翻譯活性。
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1.一種GADD34截短體，其特征在于，所述GADD34截短體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.一種權利要求1所述的GADD34截短體的制備方法，其特征在于，所述GADD34截短體的制備方法為敲除GADD34的N端第1-240位氨基酸，獲得所述GADD34截短體。
3.根據權利要求2所述的GADD34截短體的制備方法，其特征在于，包括步驟：
4.根據權利要求3所述的GADD34截短體的制備方法，其特征在于，所述引物對的核酸序列如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示。
5.一種核酸，其特征在于，所述核酸包含權利要求1所述的GADD34截短體的編碼基因，所述GADD34截短體的編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
6.一種載體，其特征在于，所述載體包括權利要求5所述的核酸。
7.一種瞬時表達GADD34截短體的細胞，其特征在于，將權利要求6所述的載體轉染至哺乳動物細胞中獲得。
8.一種細胞裂解上清液，其特征在于，由權利要求7所述的瞬時表達GADD34截短體的細
9.一種權利要求8所述的細胞裂解上清液的制備方法，其特征在于，包括步驟：
10.一種權利要求1所述的GADD34截短體在無細胞表達中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種gadd34截短體，其特征在于，所述gadd34截短體的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種權利要求1所述的gadd34截短體的制備方法，其特征在于，所述gadd34截短體的制備方法為敲除gadd34的n端第1-240位氨基酸，獲得所述gadd34截短體。
3.根據權利要求2所述的gadd34截短體的制備方法，其特征在于，包括步驟：
4.根據權利要求3所述的gadd34截短體的制備方法，其特征在于，所述引物對的核酸序列如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示。
5.一種核酸，其特征在于，所述核酸包含...
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