【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因編輯領域，特別是規律成簇的間隔短回文重復(crispr)。具體而言，本專利技術篩選到了一類cas酶，并基于該cas酶開發了相應的基因編輯工具及其應用。
技術介紹
1、crispr/cas技術是一種被廣泛使用的基因編輯技術，它通過rna引導對基因組上的靶序列進行特異性結合并切割dna產生雙鏈斷裂，利用生物非同源末端連接或同源重組進行定點基因編輯。
2、crispr/cas9系統是最常用的ii型crispr系統，它識別3’-ngg的pam基序，對靶標序列進行平末端切割。crispr/cas?type?v系統是一類新發現的crispr系統，它具有5’-ttn的基序，對靶標序列進行粘性末端切割，例如cpf1,c2c1,casx,casy。然而目前存在的不同的crispr/cas各有不同的優點和缺陷。例如cas9,c2c1和casx均需要兩條rna進行指導rna，而cpf1只需要一條指導rna而且可以用來進行多重基因編輯。casx具有980個氨基酸的大小，而常見的cas9，c2c1，casy和cpf1通常大小在1300個氨基酸左右。此外，cas9，cpf1，casx，casy的pam序列都比較復雜多樣，而c2c1識別嚴謹的5’-ttn，因此它的靶標位點比其他系統容易被預測從而降低了潛在的脫靶效應。
3、總之，鑒于目前可獲得的crispr/cas系統都受限于一些缺陷，開發一種更穩健的、具有多方面良好性能的crispr/cas系統對生物技術的發展具有重要意義。
技術實現思路
1、本申請的專利技術人經過大量實驗和反復摸索，出人意料地發現了一種核酸內切酶(cas酶)。基于這一發現，本專利技術人開發了新的crispr/cas系統以及基于該系統的基因編輯方法和核酸檢測方法。
2、cas效應蛋白
3、一方面，本專利技術提供了一類cas蛋白，所述cas蛋白是crispr/cas系統中的效應蛋白，本專利技術中將其稱之為casn蛋白。
4、本專利技術所述的casn蛋白與已報道的cas蛋白的序列一致性較低，通過與其他類別的cas酶構建進化樹，發現這些cas酶非常顯著地屬于一個獨立的進化分支，且與其他蛋白距離較遠，屬于一種新的cas蛋白的分支。
5、一方面，本專利技術提供了一種casn蛋白，所述casn蛋白包含以下一種或兩種保守結構域：
6、第一保守結構域的氨基酸為：x1nx2x3x4ex5x6x7x8x9x10；其中，x1＝d/k/n/p，x2＝f/l/y，x3＝a/g/l/p/q/v，x4＝d/f/h/y，x5＝i/l/t/v，x6＝a/v，x7＝h/k/n/r/t/v/w，x8＝a/q/r，x9＝i/l/m，x10＝i/l/v；
7、第二保守結構域的氨基酸為：x11x12x13x14x15ex16x17；其中，x11＝a/m/y，x12＝f/i/l/m/s/v/y，x13＝i/v，x14＝a/c/g，x15＝i/l/v，x16＝d/h/n/r/y，x17＝a/g/t。
8、在一個實施方式中，所述第一保守結構域的氨基酸為：x1nx2x3x4ex5x6x7x8x9x10；其中，x1＝d/n/p，x2＝y，x3＝a/v，x4＝d/f/y，x5＝t/v，x6＝a/v，x7＝h/k/t，x8＝a，x9＝i/l/m，x10＝i/v。
9、在一個實施方式中，所述第二保守結構域的氨基酸為：x11x12x13x14x15ex16x17；其中，x11＝a/m，x12＝i/l/m/v，x13＝i，x14＝g，x15＝i/l，x16＝d/h/r，x17＝a/g/t。
10、本專利技術中的casn蛋白包括casn-1、casn-3、casn-4、casn-6、casn-7，其氨基酸序列分別如seq?id?no.1-5所示。
11、在一些實施方式中，所述casn蛋白的氨基酸序列與seq?id?no.1-5任一氨基酸序列相比，具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物學功能。
12、在一個實施方式中，所述casn蛋白氨基酸序列與seq?id?no.1-5任一序列相比，具有一個或多個氨基酸的置換、缺失或添加的序列；并且基本保留了其源自的序列的生物學功能；所述一個或多個氨基酸的置換、缺失或添加包括1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個氨基酸的置換、缺失或添加。
13、在一些實施例中，本專利技術的casn蛋白能夠識別前間隔子相鄰基序(pam)，并且靶核酸包括pam或由pam組成。
14、本領域技術人員清楚，可以改變蛋白質的結構而不對其活性和功能性產生不利影響，例如，可以在蛋白質氨基酸序列中引入一個或多個保守性氨基酸取代，而不會對蛋白質分子的活性和/或三維結構產生不利影響。本領域技術人員清楚保守性氨基酸取代的實例以及實施方式。具體的說，可以用與待取代位點屬于相同組的另一氨基酸殘基取代該氨基酸殘基，即用非極性氨基酸殘基取代另一非極性氨基酸殘基，用極性不帶電荷的氨基酸殘基取代另一極性不帶電荷的氨基酸殘基，用堿性氨基酸殘基取代另一堿性氨基酸殘基，和用酸性氨基酸殘基取代另一酸性氨基酸殘基。這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的。只要取代不導致蛋白質生物活性的失活，則一種氨基酸被屬于同組的其他氨基酸替換的保守取代落在本專利技術的范圍內。因此，本專利技術的蛋白可以在氨基酸序列中包含一個或多個保守性取代,這些保守性取代最好根據表1進行替換而產生。另外，本專利技術也涵蓋還包含一個或多個其他非保守取代的蛋白，只要該非保守取代不顯著影響本專利技術的蛋白質的所需功能和生物活性即可。
15、保守氨基酸置換可以在一個或多個預測的非必需氨基酸殘基處進行。“非必需”氨基酸殘基是可以發生改變(缺失、取代或置換)而不改變生物活性的氨基酸殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性所需的。“保守氨基酸置換”是其中氨基酸殘基被具有類似側鏈的氨基酸殘基替代的置換。氨基酸置換可以在上述cas蛋白的非保守區域中進行。一般而言，此類置換不對保守的氨基酸殘基，或者不對位于保守基序內的氨基酸殘基進行，其中此類殘基是蛋白質活性所需的。然而，本領域技術人員應當理解，功能變體可以具有較少的在保守區域中的保守或非保守改變。
16、表1
17、
18、
19、本領域熟知，可以從蛋白質的n和/或c末端改變(置換、刪除、截短或插入)一或多個氨基酸殘基而仍保留其功能活性。因此，從cas蛋白的n和/或c末端改變了一或多個氨基酸殘本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種Cas蛋白，其特征在于，所述Cas蛋白為CasN蛋白，所述CasN蛋白包含以下一種或兩種保守結構域：
2.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括權利要求1所述的Cas蛋白和其他的修飾部分。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸為編碼權利要求1所述Cas蛋白的多核苷酸序列，或編碼權利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。
4.一種載體，其特征在于，所述載體包含權利要求3所述的多核苷酸以及與之可操作連接的調控元件。
5.一種CRISPR-Cas系統，其特征在于，所述系統包括權利要求1所述的Cas蛋白以及至少一種能夠與所述Cas蛋白結合的gRNA，所述gRNA包括與所述Cas蛋白結合的區域以及靶向核酸的靶向序列。
6.一種組合物，其特征在于，所述組合物包含：
7.一種工程化的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求1所述的Cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4所述的載體，或權利要求5所述的CRISPR-Cas系統，或權利要求6所述的組合物。
8.權
9.一種用于檢測樣品中的靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含：(a)權利要求1所述的Cas蛋白，或編碼所述Cas蛋白的核酸；(b)gRNA，或編碼所述gRNA的核酸，或包含所述gRNA的前體RNA，或編碼所述前體RNA的核酸；所述gRNA包括與權利要求1所述Cas蛋白結合的區域以及靶向核酸的靶向序列；和(c)為單鏈的且不與所述gRNA雜交的單鏈核酸檢測器。
10.一種檢測樣品中靶核酸的方法，所述方法包括將樣品與權利要求1所述的Cas蛋白、gRNA(指導RNA)和單鏈核酸檢測器接觸，所述gRNA包括與所述Cas蛋白結合的區域和與靶核酸雜交的指導序列；檢測由所述Cas蛋白切割單鏈核酸檢測器產生的可檢測信號，從而檢測靶核酸；所述單鏈核酸檢測器不與所述gRNA雜交。
...【技術特征摘要】
1.一種cas蛋白，其特征在于，所述cas蛋白為casn蛋白，所述casn蛋白包含以下一種或兩種保守結構域：
2.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括權利要求1所述的cas蛋白和其他的修飾部分。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸為編碼權利要求1所述cas蛋白的多核苷酸序列，或編碼權利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。
4.一種載體，其特征在于，所述載體包含權利要求3所述的多核苷酸以及與之可操作連接的調控元件。
5.一種crispr-cas系統，其特征在于，所述系統包括權利要求1所述的cas蛋白以及至少一種能夠與所述cas蛋白結合的grna，所述grna包括與所述cas蛋白結合的區域以及靶向核酸的靶向序列。
6.一種組合物，其特征在于，所述組合物包含：
7.一種工程化的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求1所述的cas蛋白，或權利要求2所述的融合蛋白，或權利要求3所述的多核苷酸，或權利要求4所述的載體，或權利要求5所述的crispr-cas系統，或權利要求6所述的組合物。
8.權利要求1所述的cas蛋白，或權利要求2所述的融合...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李珊珊，劉銳恒，
申請(專利權)人：山東舜豐生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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