【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及醫藥，具體涉及一種基于lip-ms技術篩選的紫草素作用靶點及應用。
技術介紹
1、紫草素(shikonin,sk)是從中藥紫草中提取的一種脂溶性萘醌類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗真菌等多種藥理活性。經研究發現，紫草素具有很強的抗白念珠菌活性，尤其是對氟康唑耐藥菌的抗真菌效果更為明顯。紫草素與唑類，多烯類藥物合用能夠降低這些藥物的用量，恢復其對耐藥真菌的抗菌作用，是一種良好的抗真菌藥物增效劑，然而，紫草素能與白念珠菌細胞中哪些靶點直接作用，通過何種機制對上下游基因或通路進行調控，從而發揮其抗真菌作用的，這個問題依然沒有得到很好的解答。
2、藥物靶點是藥物發揮活性的關鍵生物學基礎，藥物靶標的發現和鑒定一直是藥學各領域的研究熱點。近年來發展了多種標記和非標記的藥物靶標分析方法，相對而言，非標記的藥物靶標鑒定因無需對小分子的構效關系和標簽修飾研究進行，大大縮短了靶標分析的時間，因而得到了深入的研究和廣泛的應用，非標記藥物靶標鑒定方法主要包括darts(藥物親和響應靶標穩定性分析)、sprox(基于氧化速率的蛋白質穩定性評估)和cetsa(細胞熱位移分析)等。這些方法通過觀察藥物與靶標蛋白結合后導致的生物物理性質變化(如穩定性、氧化速率或熱穩定性)來鑒定藥物靶標。然而，這些方法也存在一定的局限性。首先，darts技術在檢測低豐度靶點方面能力有限，且靶蛋白的水解敏感性和所選蛋白酶的特異性可能影響結果。其次，sprox技術受限于蛋白質中甲硫氨酸的含量，且目前主要適用于細胞裂解物的分析，無法直接應用于活細胞系統
3、為此，本專利技術旨在提供一種基于lip-ms技術篩選的紫草素作用靶點及應用，以解決上述問題。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是為了解決上述問題，提供一種基于lip-ms技術篩選的紫草素作用靶點及應用，采用基于肽指紋譜的非標記藥物靶標分析方法，提取紫草干預下的白念珠菌細胞總蛋白，用proteinase?k進行限制性酶解，比較對照組和藥物處理組肽指紋譜的變化，篩選出紫草素處理組中專屬性的“構象保持肽段”，通過數據庫匹配鑒定紫草素抑制白念珠菌生物被膜的靶標蛋白。
2、為了達到上述目的，本專利技術的技術方案如下：
3、本專利技術提供了一種基于lip-ms技術篩選的紫草素作用靶點，所述技術包含以下步驟：
4、s1、蛋白提取：將單克隆白色念珠菌接種于1ml?ypd液體培養基中，在30℃、200轉/分鐘的條件下培養16小時；結束培養后使用pbs洗滌細胞三次，加入總量為5ml的蛋白質提取緩沖液，并與兩倍體積的酸化玻璃珠混合，在冰浴條件提取蛋白，使用bca蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，并用pbs稀釋至1.0mg/ml，儲存于-80℃冰箱待用；
5、s2、有限蛋白水解：取100μg稀釋后的蛋白溶液加入適當濃度的藥物或dmso，按酶/底物比1:100向樣品中分別加入蛋白酶k準確孵育樣品3分鐘后，加熱滅活pk；隨后加入使終濃度為5％的脫氧膽酸鈉溶液，使終濃度為12mm的二硫蘇糖醇，使終濃度為40mm的碘乙酰胺，以烷基化還原的半胱氨酸殘基；按酶/底物比wt/wt?1:100加入胰蛋白酶，37℃過夜孵育；通過加入98％vol/vol的甲酸至最終濃度為2％vol/vol來停止消化并沉淀脫氧膽酸鈉；最后高速10分鐘，以去除沉淀物，并進行脫鹽處理后，將上清液轉移以供質譜分析；
6、s3、質譜分析：質譜分析使用超高效液相色譜-質譜聯用系統(nano-uplc-ms，型號：ekspert?nano?lc?400和triple-tof?5600+，ab?sciex，美國)，該系統在chromxp?c18色譜柱(0.3mm×150mm，3μm，ab?sciex，美國)上以5μl/min的流速分離肽段。肽段的洗脫采用90分鐘的乙腈-水梯度進行。白色念珠菌蛋白質組的定量通過基于swath的質譜法實現；數據的采集和分析在1.7軟件和proteinpilot?4.5上進行；使用markerview軟件和uniprot數據庫，通過uniprot數據庫建立差異蛋白質信息表；通過比較有效肽段的差異，篩選到紫草素作用于白念珠菌潛在的靶點；
7、s4、靶點的驗證：根據是否具有藥物濃度依賴性對篩選到的靶點進行篩選和排序；通過綜合分析藥物結構，靶點功能，確認fructose-bisphosphate?aldolase為作用靶點，并采取相應驗證。
8、提供了一種基于lip-ms技術篩選的紫草素作用靶點的應用，所述fructose-bisphosphate?aldolase靶點與紫草素直接作用抗真菌。
9、本方案的有益效果：
10、本專利技術擬采用基于肽指紋譜的非標記藥物靶標分析方法，提取紫草干預下的白念珠菌細胞總蛋白，用proteinase?k進行限制性酶解，比較對照組和藥物處理組肽指紋譜的變化，篩選出紫草素處理組中專屬性的“構象保持肽段”，通過數據庫匹配鑒定紫草素抑制白念珠菌生物被膜的靶標蛋白；相比傳統的darts方法，基于肽指紋譜非標記的藥物靶標分析將檢測對象從蛋白轉變成肽段，有望表征低親和力的多靶點藥物與蛋白相互作用、低豐度蛋白、大分子量蛋白局部構象變化信息，以提高靶標分析的準確度和靈敏度。
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1.一種基于LIP-MS技術篩選的紫草素作用靶點，其特征是：所述技術包含以下步驟：
2.如權利要求1所述的一種基于LIP-MS技術篩選的紫草素作用靶點的應用，其特征是：所述Fructose-bisphosphate?aldolase靶點與紫草素直接作用抗真菌。
3.如權利要求1所述的一種基于LIP-MS技術篩選的紫草素作用靶點，其特征是：所述質譜分析使用超高效液相色譜-質譜聯用系統nano-UPLC-MS，型號：Ekspert?nano?LC?400和Triple-TOF?5600+，AB?Sciex，該系統在ChromXP?C18色譜柱上以5μl/min的流速分離肽段；肽段的洗脫采用90分鐘的乙腈-水梯度進行。
【技術特征摘要】
1.一種基于lip-ms技術篩選的紫草素作用靶點，其特征是：所述技術包含以下步驟：
2.如權利要求1所述的一種基于lip-ms技術篩選的紫草素作用靶點的應用，其特征是：所述fructose-bisphosphate?aldolase靶點與紫草素直接作用抗真菌。
3.如權利要求1所述的一種基于lip...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李玲，呂磊，王輝，樊芳，夏哲煒，陳嘯飛，
申請(專利權)人：中國人民解放軍海軍軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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