【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及雙固定化重組酵母菌株制備及萊苞迪糖苷合成，更具體的說是涉及雙固定化重組酵母工程菌及在合成萊苞迪糖苷中的應用。
技術介紹
1、過去幾十年，為了降低高熱量糖的攝入，低熱量或零熱量的人工甜味劑作為糖的功能替代品被開發并商業化，其中應用較多的是安賽蜜、三氯蔗糖和阿斯巴甜。雖然人工甜味劑滿足了人類對甜味的需求，但是他們常被報道存在潛在的健康風險(破壞人體腸道內菌群平衡和2b類致癌物等)，受到了消費者的質疑，市場占有率逐年下降。因此，安全性高、熱量低且甜度高的天然甜味劑成為了最受消費者歡迎的新型糖類替代品。
2、來源于甜葉菊葉片中天然提取物的甜菊醇糖苷(steviol?glycosides,sgs)，與甘蔗糖和甜菜糖并稱為“世界三大糖源”。sgs被公認是gras(generally?recognized?assafe)，作為食品添加劑已得到fao和who等組織認可，也被我國列入《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》(gb2760)。甜葉菊葉中，甜菊苷(st)和萊苞迪苷a(reba)含量最豐富，分別占葉片干重的5-10％(w/w)和2-4％(w/w)，但口感差(苦澀味和后苦味)，影響其廣泛應用。而reb?d/m共混物兼具甜度高(是蔗糖約300倍)、起甜速度快、甜度滯留時間長、熱穩定性好、熱量低和口感佳(無異味和后苦味)等優勢，是最佳的蔗糖替代品。但是，reb?d/m含量僅占甜葉菊干葉重0.4-0.5％(w/w)，使用傳統植物提取法1噸甜葉菊干葉中的提取量約為2kg，工藝繁瑣、污染嚴重且價格昂貴，嚴重制約了甜菊葉提取萊
3、采用生物酶轉化法是實現萊苞迪糖苷生物合成最有技術優勢的可持續替代策略。現有reb?d/m生物酶轉化法仍普遍存在以下問題：
4、(1)生產成本高。使用價格高的reb?d或reb?e為底物(含量遠低于1％)，并使用昂貴的二磷酸尿苷葡糖(udpg)作為葡萄糖基的供體底物。
5、(2)底物轉化率和產物積累量低。使用胞內表達酶的全細胞催化劑，受底物或產物跨膜運輸阻力而阻礙產物合成；并且細胞內水解酶(如內源性糖苷水解酶scw2)對產物的水解而降低產物積累量。
6、(3)酶利用率低。使用游離純酶混合共催化，純酶制備步驟多、難度大、易失活且游離酶難以回收再利用、下游產物分離純化困難，生產成本高；使用傳統酶固定化方式，需要額外進行固定化步驟，消耗固定化材料的同時降低了酶活性，且隨使用時間的增長固定化酶活呈不可逆降低。
7、因此，如何提供一種高效、可持續、低成本和高強度特色的萊苞迪糖苷的綠色生物制造技術，突破萊苞迪糖苷產業化瓶頸是本領域技術人員亟需解決的問題。
技術實現思路
1、有鑒于此，特提出本專利技術。
2、本專利技術目的之一在于提供一種雙固定化重組酵母工程菌。
3、本專利技術目的之二在于提供一種以雙固定化重組酵母工程菌生產雙固定化全細胞催化劑的方法。
4、本專利技術目的之三在于提供一種以雙固定化全細胞催化劑生產萊苞迪糖苷的方法。
5、為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
6、本專利技術實施例一方面提供了雙固定化重組酵母工程菌的構建方法，過程包括：
7、1)構建多酶復合體固定化模塊：將片段1、片段2連接在pesc-ura載體，獲得重組pesc-ura載體；片段3連接在prs424載體，獲得重組prs424載體；其中，所述片段1為由信號肽、酵母細胞壁錨定蛋白和黏附域cohe?sion組成的表面展示支架蛋白表達框；片段2為由信號肽、酵母細胞壁錨定蛋白和蔗糖合酶組成的udpg原位再生系統表達框；片段3為由啟動子、信號肽和攜帶有酶亞基的錨定域dockerin組成的多酶復合體表達框；
8、2)構建菌體無載體自固定化模塊：將片段4整合至酵母基因組上，所述片段4為由啟動子和絮凝基因組成的無載體自固定化表達框；
9、3)轉化：將重組pesc-ura載體和重組prs424載體轉入酵母細胞，完成雙固定化重組酵母工程菌的構建。
10、在優選的實施方式中，片段1中，信號肽是α因子信號肽，酵母細胞壁錨定蛋白是α-凝集素agα1，黏附域cohesion支架蛋白分別是來源于clostridiu?m?acetobutylicum的cohesion1、來源于ruminiclostridium?cellulolyticum的co?hesion2和來源于clostridium?cellulovorans的cohesion3三種cohesion使用3×g4s?linker連接組成；所述α因子信號肽、cohesion1、cohesion2、cohesio?n3和agα1的核苷酸序列分別如seq?idno.1、9、10、11和12所示；
11、片段2中，信號肽為aga2信號肽，酵母細胞壁錨定蛋白是a-凝集素aga2p，蔗糖合酶為sus01，aga2p和sus01間使用3×g4s?linker連接；所述aga2信號肽和aga2p的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；蔗糖合酶sus01的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，核苷酸序列如seqid?no.13所示。
12、在優選的實施方式中，片段3中，啟動子分別是pgk、tef1和adh1，信號肽均為α因子信號肽，錨定域dockerin互作蛋白分別是來源于c.acetobu?tylicum的dockerin1攜帶糖基轉移酶ugt01、來源于r.cellulolyticum的do?ckerin2攜帶糖基轉移酶ugt02和來源于c.cellulovorans的dockerin3糖基轉移酶ugt01；ugt01與dockerin1、ugt02與dockerin2、ugt01與docker?in3間使用3×g4s?linker連接；所述pgk_α-factor?secretion?signal_ugt01_dockerin1、tef1_α-factor?secretion?signal_ugt02_dockerin2和adh1_α-factor?secretion?signal_ugt01_dockerin3的核苷酸序列分別如seq?id?no.3、14、15所示；
13、所述糖基轉移酶ugt01的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；
14、所述糖基轉移酶ugt02的氨基酸序列如seq?id?no.6所示。
15、在優選的實施方式中，片段4中，啟動子是pgk，絮凝基因是flo1s，其核苷酸序列如seq?id?no.4所示，所述絮凝蛋白flo1s的氨基酸序列如seq?id?no.8所示。
16、在優選的實施方式中，所述酵母為畢赤酵母、釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母等酵母宿主中的任意一種；
17、在更優選的實施方式中，所述酵母為釀酒酵母awy100。
18、本專利技術實施例第二方面提供了上述所述方法構建的雙固定本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.雙固定化重組酵母工程菌的構建方法，其特征在于，過程包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，片段1中，信號肽是α因子信號肽，酵母細胞壁錨定蛋白是α-凝集素Agα1，黏附域Cohesion支架蛋白分別是來源于Clostridiumacetobutylicum的Cohesion1、來源于Ruminiclostri?dium?cellulolyticum的Cohesion2和來源于Clostridium?cellulovorans的Cohesi?on3三種Cohesion使用3×G4S?Linker連接組成；所述α因子信號肽、Cohesi?on1、Cohesion2、Cohesion3和Agα1的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.1、9、10、11和12所示；
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，片段3中，啟動子分別是PGK、TEF1和ADH1，信號肽均為α因子信號肽，錨定域Dockerin互作蛋白分別是來源于C.acetobutylicum的Dockerin1攜帶糖基轉移酶UGT01、來源于R.cellulolyticum的Dockerin
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，片段4中，啟動子是PGK，絮凝基因是FLO1s，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述絮凝蛋白FL?O1s的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.8所示。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母為畢赤酵母、釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母等酵母宿主中的任意一種；
6.權利要求1-5任一所述方法構建的雙固定化重組酵母工程菌。
7.權利要求6所述的雙固定化重組酵母工程菌在制備雙固定化重組酵母全細胞催化劑以及合成萊苞迪糖苷中的應用。
8.以權利要求6所述的雙固定化重組酵母工程菌制備雙固定化重組酵母全細胞催化劑的方法，其特征在于，過程包括：
9.一種合成萊苞迪糖苷RebD/M的方法，其特征在于，過程包括：
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，培養基1為SD-SCAA-Leu-Trp-Ura培養基，含YNB?13.4g/L，氨基酸缺失混合物DO?Supplement-Leu/-Trp/-Ura?0.6g/L，葡萄糖20g/L；
...【技術特征摘要】
1.雙固定化重組酵母工程菌的構建方法，其特征在于，過程包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，片段1中，信號肽是α因子信號肽，酵母細胞壁錨定蛋白是α-凝集素agα1，黏附域cohesion支架蛋白分別是來源于clostridiumacetobutylicum的cohesion1、來源于ruminiclostri?dium?cellulolyticum的cohesion2和來源于clostridium?cellulovorans的cohesi?on3三種cohesion使用3×g4s?linker連接組成；所述α因子信號肽、cohesi?on1、cohesion2、cohesion3和agα1的核苷酸序列分別如seq?id?no.1、9、10、11和12所示；
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，片段3中，啟動子分別是pgk、tef1和adh1，信號肽均為α因子信號肽，錨定域dockerin互作蛋白分別是來源于c.acetobutylicum的dockerin1攜帶糖基轉移酶ugt01、來源于r.cellulolyticum的dockerin2攜帶糖基轉移酶ugt02和來源于c.cellulov?orans的dockerin3糖基轉移酶ugt01；其pgk_α-factorsecretion?signal_ug?t01_dockerin1、tef1_α-factor?secretion?signal_ugt02_d...
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。