【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程疫苗領域，具體是涉及共同表達ndv?f基因和h9亞型aiv?ha基因的重組火雞皰疹病毒的構建方法及應用。
技術介紹
1、新城疫(nd)是由新城疫病毒(ndv)引起的家禽的一種烈性、高度接觸性、呼吸道傳染病。目前新城疫呈全球性分布，給世界各地的養殖業和相關產品的進出口貿易帶來了巨大的損失。目前nd主要通過滅活疫苗和弱毒活疫苗進行防控。由于弱毒活疫苗的免疫效果易受母源抗體干擾，滅活疫苗免疫持續期不長，使得現地nd疫苗必須要多次免疫才能達到免疫效果，增加了雞群免疫壓力與養殖負擔。因此，目前市場迫切需求不受母源抗體干擾，適于雛雞早期接種且免疫持續期長的新型nd疫苗。
2、h9亞型禽流感病毒(aiv)于1966年首次在美國火雞群中分離獲得，目前已呈世界性分布，其在家禽中的廣泛流行給全球養禽業和公共衛生安全構成了持續的威脅。h9亞型禽流感目前主要通過滅活疫苗進行防控，然而近年來h9亞型aiv在我國的分離率逐年上升，表明傳統滅活疫苗免疫已不能有效防控h9亞型aiv感染，迫切需要研制更加安全、高效的新型疫苗。
3、火雞皰疹病毒(hvt)是一種對雞無致病性的皰疹病毒，基因組較大，可供外源基因插入或替換的復制非必需基因多，是一種理想的構建重組活載體疫苗的病毒載體。與其它病毒載體相比，hvt作為病毒載體具有許多優勢。其對雞及其它動物均無致病性，使用安全；hvt疫苗免疫效果不受母源抗體干擾，適于孵化場1日齡雛雞的早期免疫；接種雞體后hvt在雞體內長期存在，刺激機體產生較高的抗體水平并維持終身，接種一次即可獲
4、國內外研發人員開發了一系列基于火雞皰疹病毒hvt載體的重組病毒載體疫苗株，如新城疫病毒(ndv)、雞傳染性法氏囊病毒(ibdv)、h9亞型禽流感病毒(aiv)、雞傳染性喉氣管炎病毒(iltv)等。這些載體疫苗有效地克服了滅活疫苗和弱毒活疫苗免疫效果易受母源抗體干擾的缺陷，有效地解決了病毒容易感染早期雛雞的現狀。將單獨表達不同外源基因的重組火雞皰疹病毒同時接種1日齡雞后，會出現兩種或多種重組病毒載體疫苗在雞體內互相競爭的問題，從而導致免疫失敗，而且將不同種類的外源基因同時插入到同一火雞皰疹病毒載體又會出現只對其中一種病有良好免疫效果的問題，或對所有疫病免疫效果都不理想的結果，因此亟需一種能夠同時表達多種外源抗原基因且穩定傳代，并提供良好免疫保護效果的重組hvt載體疫苗。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種共同表達新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火雞皰疹病毒。
2、本專利技術的目的還在于提供一種共同表達新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火雞皰疹病毒的構建方法。
3、本專利技術的目的還在于提供一種共同表達新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火雞皰疹病毒的應用。
4、為實現以上技術目的，本專利技術采用如下技術方案：
5、共同表達新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火雞皰疹病毒，所述重組火雞皰疹病毒是將包含雞β肌動蛋白啟動子、新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因編碼序列f2aha、土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節序列、兔β球蛋白多聚腺苷酸序列的表達框架cagw-f2aha插入火雞皰疹病毒基因組后獲得；
6、所述編碼序列f2aha是由新城疫病毒f基因編碼序列和h9亞型禽流感病毒ha基因編碼序列以豬捷申病毒2a自剪切肽編碼序列連接獲得，所述編碼序列f2aha的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；
7、所述表達框架cagw-f2aha是將f2aha克隆入pcaggs載體的雞β肌動蛋白啟動子和兔β球蛋白多聚腺苷酸序列之間，并將土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節序列插入f2aha序列與兔β球蛋白多聚腺苷酸序列之間獲得，所述表達框架cagw-f2aha的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
8、所述共同表達新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火雞皰疹病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：
9、(1)火雞皰疹病毒fc126株多片段黏粒拯救系統的建立
10、提取fc126株基因組dna，將fc126株基因組dna分段克隆至pcc1fos載體，選取6個克隆有fc126株基因組dna片段并可拼接覆蓋完整hvt基因組的重組黏粒hvt01、hvt02、hvt03、hvt04、hvt05、hvt06；其中，hvt01包含fc126基因組1-30189位的核苷酸片段、hvt02包含fc126基因組21572-61476位的核苷酸片段、hvt03包含fc126基因組50871-90478位的核苷酸片段、hvt04包含fc126基因組73762-108139位的核苷酸片段、hvt05包含fc126基因組96776-135815位的核苷酸片段、hvt06包含fc126基因組129602-159160位的核苷酸片段；
11、(2)表達新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因的重組黏粒的構建
12、構建包含雞β肌動蛋白啟動子、ndv?f基因和aiv?ha基因編碼序列、土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節序列以及兔β球蛋白多聚腺苷酸序列表達框架cagw-f2aha的重組表達質粒，其中，f基因和ha基因編碼區之間以豬捷申病毒2a自剪切肽編碼序列連接；利用red/et重組方法將所述的表達框架cagw-f2aha克隆入重組黏粒hvt04中fc126基因組的95322-95323位核苷酸之間，構建獲得共同表達f基因和ha基因的重組黏粒，命名為hvt04-53-f2aha；利用red/et重組方法將所述的表達框架cagw-f2aha克隆入重組黏粒hvt05中fc126基因組的112071-112088位核苷酸之間，構建獲得共同表達f基因和ha基因的重組黏粒，命名為hvt05-65-f2aha；
13、(3)表達新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因的重組hvt的拯救
14、提取重組黏粒hvt04-53-f2aha、hvt05-65-f2aha以及克隆有hvt?fc126株基因組片段的親本黏粒hvt01、hvt02、hvt03、hvt04、hvt05、hvt06；利用磷酸鈣轉染法，將重組黏粒hvt04-53-f2aha與親本黏粒hvt01、hvt02、hvt03、hvt05、hvt06共轉染cef細胞，拯救獲得在hvt基因組95322-95323位核苷酸之間插入表達框架f2aha的重組病毒h20901；利用磷酸鈣轉染法，將重組黏粒hvt05-65-f2aha與親本黏粒hvt01、hvt02、hvt03、hvt04、hvt06共轉染cef細胞，拯救獲得在hvt基因組112071-112088位核苷酸之間插入表達框架f2aha的重組病毒h20902。
15、所述的共同表達新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火雞皰疹病毒在制備本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.共同表達新城疫病毒F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒，其特征在于，所述重組火雞皰疹病毒是將包含雞β肌動蛋白啟動子、新城疫病毒F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因編碼序列F2AHA、土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節序列、兔β球蛋白多聚腺苷酸序列的表達框架CAGW-F2AHA插入火雞皰疹病毒基因組后獲得；
2.一種構建權利要求1所述共同表達新城疫病毒F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.一種如權利要求1所述的共同表達新城疫病毒F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因的重組火雞皰疹病毒在制備新城疫、禽流感病毒疫苗中的應用。
【技術特征摘要】
1.共同表達新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火雞皰疹病毒，其特征在于，所述重組火雞皰疹病毒是將包含雞β肌動蛋白啟動子、新城疫病毒f基因和h9亞型禽流感病毒ha基因編碼序列f2aha、土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節序列、兔β球蛋白多聚腺苷酸序列的表達框架cagw-f2aha插入火雞皰疹病毒基因...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李凱，田世茂，李曉涵，王笑梅，李守軍，車艷杰，朱秀同，
申請(專利權)人：中國農業科學院都市農業研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。