鐘蛋白穿膜肽藥物載體制造技術

一種鐘蛋白穿膜肽藥物載體，其特征是結構式為Ｘ－Ｃ－Ｙ，其中，Ｘ和Ｙ均是氨基酸序列、核酸序列或無，Ｃ是一種穿膜肽，其氨基酸序列為：　　　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　Ｘａａ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　　　１　　５　　１０　　　　其中Ｘａａ＝Ｖａｌ或Ａｌａ。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及醫藥，特別是一種藥物載體。該藥物載體命名為鐘蛋白穿膜肽藥物載體。
技術介紹
人體天然的生物屏障，如血腦屏障、細胞膜屏障等，雖有重要的保護作用，但使許多藥物達不到治療部位或在治療部位的濃度遠低于有效治療濃度而不能充分發揮藥效，不利于這些部位病變的治療。為了克服血腦屏障、細胞膜屏障對藥物轉運的限制，已有用滲透壓來打開內皮細胞間的緊密連接以打開血腦屏障，但這樣做極具侵襲性，易使不需要的甚至是有害的物質進入顱內；有用脂質體包裹藥物來突破細胞膜屏障，效果雖好，但有一定細胞毒性；有用親脂性的前體藥物來通過親脂性生物膜，雖然能通過血腦屏障和細胞膜屏障，但這種方法通常不易實現。此外，病毒載體(如腺病毒、腺相關病毒等)用于基因治療時，也能跨越血腦屏障和細胞膜屏障，但是由于病毒基因易突變性，使病毒載體對人體有潛在的致病性。
技術實現思路
鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種能攜帶藥物直接穿過血腦屏障、細胞膜屏障的鐘蛋白穿膜肽藥物載體。研究發現一類蛋白結構域具有介導異源蛋白、寡聚核酸、金屬螯合物等極性大分子直接穿過細胞膜進入胞漿和核內的功能，這一蛋白結構域命名為穿膜肽(MembranePenetrating Peptide，MPP)。這一類蛋白可以作為藥物載體攜帶藥物穿過血腦屏障、細胞膜屏障等，提高藥物的療效。本專利技術的一種鐘蛋白穿膜肽藥物載體，結構式為X-C-Y，其中，X和Y均是任意的氨基酸序列、核酸序列或無，C是一種穿膜肽其氨基酸序列為Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其中Xaa＝Val或Ala。本專利技術的鐘蛋白穿膜肽藥物載體中，C是人的節律蛋白中CLOCK蛋白(鐘蛋白)里的一段氨基酸序列。由于C來源于人，應用于人體上時不會引起免疫上的問題。C具有穿膜肽的特性，可以直接穿過血腦屏障、細胞膜屏障等。鐘蛋白穿膜肽藥物載體可以單獨或攜帶藥物穿過血腦屏障、細胞膜屏障等，提高藥物在特定區域的濃度，提高藥物的療效。上述穿膜肽具有如下特性1)非能量依賴性，非經典胞吞作用。實驗證明在4℃時，盡管胞吞作用已失活，但是MPP和MPP融合蛋白仍能快速有效地進入細胞，且穿膜效率與在37℃時沒有明顯差別。(2)可以與其它較大分子的多肽、蛋白質、核酸及金屬螯合物共價連接，仍能保持MPP穿膜活性和被介導物質的活性。本專利技術所述鐘蛋白穿膜肽藥物載體中C連接藥物的方法，即在多肽上連接藥物的方法，是本領域技術人員所熟知的方法。本專利技術的鐘蛋白穿膜肽藥物載體，其結構式可以是只有單獨的穿膜肽C。本專利技術的鐘蛋白穿膜肽藥物載體，其結構式可以是X-C-Y、C-Y、X-C，即可以在穿膜肽C的兩端的氨基端或羧基端加上基團進行修飾但不影響其生物學性質的組合物，或者是其連接上任意氨基酸序列或核酸序列或其它分子。在上述X-C-Y結構式中，Y可以為多肽p53(12-26)，多肽p53(12-26)連接在穿膜肽C的羧基端，其序列為Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg Pro Pro Leu1 5 10 15Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu20 25在上述X-C-Y結構式中，Y可以為多肽p53(12-26)，而X可以無。其結構式為X-C-多肽p53(12-26)、C-多肽p53(12-26)。上述的多肽p53(12-26)，是人來源p53蛋白中包含第12到第26個氨基酸的氨基酸序列，Y連接在穿膜肽C的羧基端。該鐘蛋白穿膜肽藥物載體可以是指將編碼上述氨基酸序列穿膜肽C的核酸序列和編碼Y多肽p53(12-26)的核酸序列放置于同一閱讀框內，通過表達這一閱讀框中的核酸序列而形成鐘蛋白穿膜肽藥物載體X-C-Y。上述的氨基酸序列中的氨基酸可以是未經修飾的天然氨基酸，也可以是經化學或其它方式修飾過的氨基酸而不影響該序列的生物學特性。本專利技術的鐘蛋白穿膜肽藥物載體可以采用通常的化學合成法合成。本專利技術的鐘蛋白穿膜肽藥物載體穿過細胞膜屏障、血腦屏障的實驗氨基端標記熒光素FITC(異硫氰酸熒光素)，高效液相色譜法分析純度，純度大于95％。取兩個六孔板，加入載玻片，接種ECV(血管內皮細胞)，密度為2*105/孔，培養過夜(約16h)，在細胞貼壁后，更換新鮮培養液，一個6孔板放入4℃冰箱中，一個繼續在37℃的孵箱中，30分鐘后，去掉培養液，更換含有上述穿膜肽C的1640培養液1ml。細胞與穿膜肽C孵化一定時間后，去掉培養液，細胞用PBS洗3次，用3.7％的多聚甲醛溶液(PBS配置)在室溫下固定5分鐘，再用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗3次，在熒光顯微鏡下觀察。可見帶有熒光的肽段穿過細胞膜聚集在核中。穿膜肽C在濃度為1μM/L時，分別在4℃和37℃時二者穿膜效率相當。由于在4℃時，細胞的胞吞作用失活，說明胞吞作用在穿膜肽的內化過程中不占主導作用。對照組采用FITC熒光素在濃度為10μM/L時對血管內皮細胞ECV-304的作用，顯示FITC熒光素不能直接進入細胞內。大鼠頸動脈注射氨基端標記FITC熒光素的上述氨基酸序列的穿膜肽C，200nmol/只，在30分鐘后取腦，做冠狀切片，鋪片后熒光顯微鏡下觀察。可見帶有熒光的肽段進入腦中。小鼠腹腔注射氨基端標記FITC熒光素上述氨基酸序列的穿膜肽C，40nmol/只，在40分鐘后取腦，做冠狀切片，鋪片后熒光顯微鏡下觀察。可見帶有熒光的穿膜肽C進入腦中。實驗證明，本專利技術的鐘蛋白穿膜肽藥物載體能攜帶藥物直接穿過血腦屏障、細胞膜屏障，使藥物能直達病變部位，從而能提高藥物的療效。可用于攜帶藥物治療腫瘤，尤其可用于治療乳腺癌，使腫瘤細胞壞死而不影響正常細胞。下面將用實施例來進一步說明本專利技術。具體實施例方式實施例1本專利技術的一種鐘蛋白穿膜肽藥物載體，其結構式為X-C-Y，其中X、Y為無，即只有單獨的穿膜肽C，其氨基酸序列為Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其中Xaa＝Val或Ala。采用已有的固相多肽化學合成方法來合成穿膜肽C。Merrifield的(Merrifield RB.1963 J Am Chem soc.852149)。其步驟如下取適量的肽合成樹脂放入反應管中。加入溶劑使樹脂溶脹。按穿膜肽C的序列依次加入Fomc保護的氨基酸適量于容器中。按多肽固相化學合成方法，根據穿膜肽C的序列從C端開始進行多肽合成。向反應管中加入含六氫吡啶20％的DMF Deblock液洗脫樹脂的Fomc保護基團。加入DMF溶解的Fomc保護的氨基酸適量于反應管中。然后加入二異丙基乙胺和氮雜苯并三唑甲基脲六磷酸鹽的DMF溶液進行偶聯反應。再用DMF洗去未反應的Fomc保護的氨基酸，采用惰性氣體吹干。反復循環進行上述步驟，直至按穿膜肽C的序列合成的多肽序列完成。從反應管中取出樹脂，在冷凍干燥機中冷凍干燥備用。把干燥后的樹脂放入合適的容器中。向容器中加入裂解液，裂解液配方為三氟乙酸∶硫代苯甲醚∶苯甲醚1，2-乙二硫醇為90∶5∶2∶3(體積比)。在室溫下避光靜置兩小時。過濾，保留濾液，將濾液本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種鐘蛋白穿膜肽藥物載體，其特征是結構式為X-C-Y，其中，X和Y均是氨基酸序列、核酸序列或無，C是一種穿膜肽，其氨基酸序列為Lys Arg Xaa Ser Arg Asn Lys Ser Glu Lys Lys Arg Arg1 5 10其中Xaa＝Val或Ala。2.根據權利要求1的一種鐘蛋白穿膜肽藥物載體，其特征是Y為多肽p53(12-26)，是人來源p53蛋白中包含第12到第...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王正榮，彭濤，楊春蕾，王躍锜，
申請(專利權)人：王正榮，四川大學，
類型：發明
國別省市：