【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及細(xì)胞分離培養(yǎng)，尤其涉及一種藏綿羊原代精原干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
1、精原干細(xì)胞(spermatogonial?stem?cells,sscs)是雄性動物睪丸內(nèi)的一種生殖干細(xì)胞，能夠增殖分化產(chǎn)生精子，將遺傳信息傳遞給下一代。理論上，sscs可在體外大量增殖，是轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)、種質(zhì)資源保護(hù)以及生殖醫(yī)學(xué)發(fā)展等領(lǐng)域中理想的細(xì)胞來源。目前，精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)在小鼠、大鼠等模式動物上的研究比較成熟，而在大動物上進(jìn)展緩慢。然而，迄今為止，仍沒有建立起能夠支持家畜等大動物sscs增殖和維持干性的長期培養(yǎng)體系，且培養(yǎng)后的sscs不能在免疫功能缺陷的同一物種受體睪丸中重建供體來源的精子發(fā)生。大動物體外長期培養(yǎng)體系的建立，不僅有助于研究sscs的生物學(xué)功能，而且對sscs的應(yīng)用(如遺傳修飾、輔助生殖等)至關(guān)重要。因此，對家畜等大動物sscs體外長期培養(yǎng)條件的深入研究為后續(xù)sscs應(yīng)用于實(shí)踐奠定了基礎(chǔ)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種藏綿羊原代精原干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為后續(xù)sscs應(yīng)用于實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)提供以下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了一種藏綿羊原代精原干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
4、(1)取藏綿羊羔羊睪丸組織消毒清洗，得到組織塊；
5、(2)剪碎所述組織塊，經(jīng)消化、清洗、重懸得到曲細(xì)精管的單細(xì)胞懸液；
6、(3)將所述單細(xì)胞懸液純化，得到藏綿羊原代精原干
7、(4)將所述藏綿羊原代精原干細(xì)胞進(jìn)行無飼養(yǎng)層或有飼養(yǎng)層培養(yǎng)；
8、所述無飼養(yǎng)層培養(yǎng)為使用無飼養(yǎng)層memα培養(yǎng)基或stemprotm-34sfm完全培養(yǎng)基在層粘連蛋白包被的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)；
9、所述有飼養(yǎng)層培養(yǎng)是在小鼠成纖維細(xì)胞系飼養(yǎng)層中或在藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，并加入飼養(yǎng)層memα培養(yǎng)基。
10、優(yōu)選的，所述藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法為：采集步驟(1)所述藏綿羊羔羊的新鮮睪丸組織，處理成無菌組織塊，依次用膠原蛋白酶iv和胰蛋白酶消化，終止消化后，將消化液逐級過篩，收集細(xì)胞；所述細(xì)胞重懸后采用percoll細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，收集11％～19％和27％～35％percoll梯度的懸浮細(xì)胞液，進(jìn)行純化，得到純化的藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞；然后用絲裂霉素c處理所述藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞，再將處理后的藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，所述細(xì)胞懸液在0.1％明膠預(yù)包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，得到藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞飼養(yǎng)層。
11、優(yōu)選的，所述消化液逐級過篩的篩網(wǎng)依次為80～100目、170～200目、270～300目；所述percoll細(xì)胞分離液的梯度濃度為10-12％、18-20％、26-28％、34-36％和42-44％。
12、優(yōu)選的，所述無飼養(yǎng)層memα培養(yǎng)基按50ml體系配制，添加如下成分：48～49ml?memα培養(yǎng)基，0.4～0.6ml?fbs，0.4～0.6ml青霉素-鏈霉素，95～105μl?18～22ng/ml?gdnf，45～55μl?9～11ng/ml?bfgf，45～55μl900～1100u/ml?lif和45～55μl?9～11ng/ml?sdf-1。
13、優(yōu)選的，所述stemprotm-34sfm培養(yǎng)基按50ml體系配制，添加如下成分：44～45mlstemprotm-34sfm培養(yǎng)基，0.4～0.6mlfbs，0.4～0.6ml青霉素-鏈霉素，0.4～0.6ml?1％非必需氨基酸，45～55μl?10μg/ml胰島素，45～55μl?10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，0.4～0.6ml?1％β-巰基乙醇，0.4～0.6ml?1％丙酮酸鈉，45～55μl?19～21μg/ml腐胺，0.4～0.6ml?1％l-谷氨酰胺，0.4～0.6ml?1％維生素，0.4～0.6ml?9～11mm?hepes緩沖劑，0.8～1.2ml?2％stempro神經(jīng)添加劑，90～110μl19～21ng/ml?gdnf，45～55μl?9～11ng/mlbfgf，45～55μl1000u/ml?lif和45～55μl?9～11ng/ml?sdf-1。
14、優(yōu)選的，所述飼養(yǎng)層memα培養(yǎng)基按50ml體系配制，添加如下成分：48～49ml?memα培養(yǎng)基，0.4～0.6mlfbs，0.4～0.6ml青霉素-鏈霉素，90～110μl?19～21ng/ml?gdnf，48～52μl?9～11ng/ml?bfgf，48～52μl?900～1100u/ml?lif和48～52μl?9～11ng/ml?sdf-1。
15、本專利技術(shù)提供的一種藏綿羊原代精原干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，能夠分離得到更高純度的藏綿羊精原干細(xì)胞，且能顯著促進(jìn)精原干細(xì)胞后續(xù)增殖，抑制其凋亡。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種藏綿羊原代精原干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法為：采集步驟(1)所述藏綿羊羔羊的新鮮睪丸組織，處理成無菌組織塊，依次用膠原蛋白酶IV和胰蛋白酶消化，終止消化后，將消化液逐級過篩，收集細(xì)胞；所述細(xì)胞重懸后采用Percoll細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，收集11％～19％和27％～35％Percoll梯度的懸浮細(xì)胞液，進(jìn)行純化，得到純化的藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞；然后用絲裂霉素C處理所述藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞，再將處理后的藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，所述細(xì)胞懸液在0.1％明膠預(yù)包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，得到藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞飼養(yǎng)層。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述消化液逐級過篩的篩網(wǎng)依次為80～100目、170～200目、270～300目；所述Percoll細(xì)胞分離液的梯度濃度為10-12％、18-20％、26-28％、34-36％和42-44％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述無飼養(yǎng)層MEMα培
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述StemProTM-34SFM培養(yǎng)基按50mL體系配制，添加如下成分：44～45mLStemProTM-34SFM培養(yǎng)基，0.4～0.6mL?FBS，0.4～0.6mL青霉素-鏈霉素，0.4～0.6mL?1％非必需氨基酸，45～55μL?10μg/mL胰島素，45～55μL?10μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，0.4～0.6mL?1％β-巰基乙醇，0.4～0.6mL?1％丙酮酸鈉，45～55μL?19～21μg/mL腐胺，0.4～0.6mL?1％L-谷氨酰胺，0.4～0.6mL?1％維生素，0.4～0.6mL?9～11mM?Hepes緩沖劑，0.8～1.2mL?2％StemPro神經(jīng)添加劑，90～110μL19～21ng/mL?GDNF，45～55μL?9～11ng/mL?bFGF，45～55μL?1000U/mL?LIF和45～55μL?9～11ng/mL?SDF-1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述飼養(yǎng)層MEMα培養(yǎng)基按50mL體系配制，添加如下成分：48～49mL?MEMα培養(yǎng)基，0.4～0.6mL?FBS，0.4～0.6mL青霉素-鏈霉素，90～110μL?19～21ng/mL?GDNF，48～52μL?9～11ng/mLbFGF，48～52μL?900～1100U/mL?LIF和48～52μL?9～11ng/mL?SDF-1。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種藏綿羊原代精原干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法為：采集步驟(1)所述藏綿羊羔羊的新鮮睪丸組織，處理成無菌組織塊，依次用膠原蛋白酶iv和胰蛋白酶消化，終止消化后，將消化液逐級過篩，收集細(xì)胞；所述細(xì)胞重懸后采用percoll細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，收集11％～19％和27％～35％percoll梯度的懸浮細(xì)胞液，進(jìn)行純化，得到純化的藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞；然后用絲裂霉素c處理所述藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞，再將處理后的藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，所述細(xì)胞懸液在0.1％明膠預(yù)包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)成單層細(xì)胞，得到藏綿羊原代睪丸支持細(xì)胞飼養(yǎng)層。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述消化液逐級過篩的篩網(wǎng)依次為80～100目、170～200目、270～300目；所述percoll細(xì)胞分離液的梯度濃度為10-12％、18-20％、26-28％、34-36％和42-44％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述無飼養(yǎng)層memα培養(yǎng)基按50ml體系配制，添加如下成分：48～49ml?memα培養(yǎng)基，0.4～0.6ml?fbs，0.4～0.6ml青霉素-鏈霉素，95～105μl?18～22ng/ml?gdnf，45～55μl?9～11ng/ml?bfgf，45～55μl?900～1100u/mllif和45～5...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：安雪姣，盧曾奎，袁超，張淼荗，劉建斌，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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